三七中黄酮糖基转移酶的筛选与鉴定

聂锋; 侯茂奇; 赵嘉宁; 王如锋; 赵淑娟

doi:10.16306/j.1008-861x.2021.06.011

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三七中黄酮糖基转移酶的筛选与鉴定

实验研究 | 更新时间：2022-09-09

- 三七中黄酮糖基转移酶的筛选与鉴定
- Screening and identification of flavonoid glycosyltransferases from Notoginseng Radix et Rhizoma
- 角色： First author , 第一作者 ,
  
  机构：
  上海中医药大学中药研究所，中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室，中药标准化教育部重点研究室，上海市中药复方重点实验室（上海　201203）
  
  邮箱：
  
  简介：聂锋，男，在读硕士生，主要从事中药生物技术研究
  
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  聂锋
  ，
  角色：
  
  机构：
  上海中医药大学中药研究所，中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室，中药标准化教育部重点研究室，上海市中药复方重点实验室（上海　201203）
  
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  侯茂奇
  ，
  角色：
  
  机构：
  上海中医药大学中药研究所，中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室，中药标准化教育部重点研究室，上海市中药复方重点实验室（上海　201203）
  
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  赵嘉宁
  ，
  角色：
  
  机构：
  上海中医药大学中药研究所，中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室，中药标准化教育部重点研究室，上海市中药复方重点实验室（上海　201203）
  
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  王如锋
  ，
  角色： Corresponding author , 通讯作者 ,
  
  机构：
  上海中医药大学中药研究所，中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室，中药标准化教育部重点研究室，上海市中药复方重点实验室（上海　201203）
  
  邮箱： zhaoshujuan@126.com
  
  简介：赵淑娟，研究员，博士生导师；E-mail：zhaoshujuan@126.com
  
  暂无本作者相关信息
  赵淑娟
  ，
- 上海中医药大学学报 2021年35卷第6期页码：73-81
- 作者机构：
  
  1.上海中医药大学中药研究所，中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室，中药标准化教育部重点研究室，上海市中药复方重点实验室（上海　201203）
- 作者简介：
  
  聂锋，男，在读硕士生，主要从事中药生物技术研究
  赵淑娟，研究员，博士生导师；E-mail：zhaoshujuan@126.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金资助项目(81573581)
- DOI：10.16306/j.1008-861x.2021.06.011
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聂锋, 侯茂奇, 赵嘉宁, 等. 三七中黄酮糖基转移酶的筛选与鉴定[J]. 上海中医药大学学报, 2021,35(6):73-81.

NIE Feng, HOU Maoqi, ZHAO Jianing, et al. Screening and identification of flavonoid glycosyltransferases from Notoginseng Radix et Rhizoma[J]. Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2021,35(6):73-81.
聂锋, 侯茂奇, 赵嘉宁, 等. 三七中黄酮糖基转移酶的筛选与鉴定[J]. 上海中医药大学学报, 2021,35(6):73-81. DOI： 10.16306/j.1008-861x.2021.06.011.

NIE Feng, HOU Maoqi, ZHAO Jianing, et al. Screening and identification of flavonoid glycosyltransferases from Notoginseng Radix et Rhizoma[J]. Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2021,35(6):73-81. DOI： 10.16306/j.1008-861x.2021.06.011.

三七中黄酮糖基转移酶的筛选与鉴定

聂锋 ; 侯茂奇 ; 赵嘉宁 ; 王如锋 ; 赵淑娟 ;

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摘要

目的：

将前期克隆得到21条三七来源的糖基转移酶基因，构建到pCold表达载体，以实现重组蛋白的可溶性表达，并筛选、鉴定其在体外对黄酮类化合物的催化功能。

方法：

对21条糖基转移酶基因进行系统进化树分析；利用同源重组的方法将其克隆到pCold表达载体上，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。低温诱导重组蛋白表达，以黄酮类化合物为糖基受体底物，UDP-葡萄糖为糖基供体，采用高效液相色谱法（HPLC）检测酶促反应产物。

结果：

分别以山柰酚和芹菜素为底物，重组蛋白PnUGT82参与反应后，可检测到山柰酚7-O葡萄糖苷和芹菜素7-O葡萄糖苷，而阴性对照组未检测到对应的糖苷产物。

结论：

筛选得到1条三七来源的糖基转移酶PnUGT82，能够催化黄酮类化合物，在体外将UDP-葡萄糖上的葡萄糖基团转移到山柰酚或芹菜素7位羟基，形成相应的黄酮7-O糖苷化产物。

Abstract

Objective:

Twenty-one glycosyltransferase genes, cloned from Notoginseng Radix et Rhizoma in previous study, are separately constructed into pCold expression vector to realize the soluble expression of recombinant protein, and their catalytic function towards flavonoids in vitro is screened and identified.

译

Methods:

Phylogenetic tree analysis was performed using 21 glycosyltransferase genes.These genes were separately cloned into pCold expression vector by homologous recombination, and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli.The recombinant proteins were induced to express at low temperature.Taken flavonoids as glycosyl receptor substrates and UDP-glucose as glycosyl donor, the enzymatic reaction products were detected by high performance liquid chromatography(HPLC) .

译

Results:

Using kaempferol and apigenin as substrates respectively, kaempferol 7-O glucoside and apigenin 7-O glucoside could be detected after the recombinant protein PnUGT82 participated in the reaction; while the corresponding glycoside products were not detected in the negative control group.

译

Conclusion:

A glucosyltransferase PnUGT82 from Notoginseng Radix et Rhizoma is obtained, which can catalyze flavonoids.The glucosyl from UDP-glucose is transferred to the 7-hydroxyl of kaempferol or apigenin, to form the corresponding flavonoid 7-O glycoside products in vitro.

译

关键词

三七; 黄酮; 糖基转移酶; 重组蛋白; 催化功能

Keywords

Notoginseng Radix et Rhizoma; flavonoid; glycosyltransferase; recombinant protein; catalytic activity

译

中药三七是五加科人参属多年生草本植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根及根茎^[

1]。三七中黄酮类成分主要是黄酮醇及其苷类^{[参考文献 2

百度学术

2]}。黄酮类成分在自然界中广泛存在，是一类具有C6-C3-C6基本母核的天然产物^{[参考文献 3

百度学术

3]}。大部分黄酮类化合物在植物体内以苷的形式存在。植物体内黄酮类化合物的糖基化多是由UDP-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferase，UGTs）催化实现，该酶将糖基从活化的糖基供体转移到受体分子上，从而衍生出结构多样的黄酮糖苷类化合物。黄酮糖苷类化合物在医药保健品及食品中具有重要价值，药理研究表明，其有扩张动脉血管、增强心肌收缩力、稳定心率、改善血循环、防治血栓等作用^{[参考文献 4-6

4-6]}。研究报道，山柰酚7-O葡萄糖苷在体外具有抗艾滋病（HIV-1）活性^{[参考文献 7

百度学术

7]}，芹菜素7-O葡萄糖苷具有抗痉挛、抗炎、抗氧化作用^{[参考文献 8

百度学术

8]}。

植物中可能存在的黄酮糖苷合成途径如图1所示^[

9]。简而言之，查尔酮在查尔酮异构酶作用下合成多种结构不同的黄酮类化合物，再由UGTs催化形成各种黄酮糖苷。随着代谢工程及合成生物学的迅速发展，借助模式微生物进行代谢改造，合成植物源黄酮糖苷已取得一定进展^{[参考文献 10-11

10-11]}。筛选三七中具有黄酮7-O糖基化功能的糖基转移酶，阐明其催化活性，有利于促进天然黄酮类化合物的糖基化修饰研究。

图1 三七中可能存在的黄酮糖苷合成途径

PAL：苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonia-lyase）；C4H：肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase）；4CL：4-香豆酰辅酶A连接酶（4-coumarate CoA ligase）；CHS：查尔酮合酶（chalcone synthase）；CHI：查尔酮异构酶（chalcone isomerase）；UFGTs：UDP-黄酮糖基转移酶（UDP-flavonoid-glycosyltransferases）。实线箭头表示已证明的途径，虚线箭头表示推测的途径

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课题组前期从三七中克隆得到21条糖基转移酶基因。本研究将其在大肠杆菌中进行异源表达，并以黄酮类化合物为糖基受体底物，UDP-葡萄糖为糖基供体，通过体外酶促反应筛选具有催化活性的糖基转移酶，以揭示或丰富三七中黄酮类化合物的生源合成途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 分子克隆实验相关材料

所用引物由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的CE Design软件进行引物设计，并由上海生工生物有限公司合成。引物序列如表1所示。PCR扩增模板为实验室保存的带有相应基因的质粒。超高保真长片段PCR预混液（批号：30245702），购自上海创英生物科技有限公司；BamHI、SalI限制性核酸内切酶，购自美国Thermo Fisher公司；One step Cloning试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。实验室冻存大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，并制备LB培养基（酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L）。

表1 构建pCold-UGTs表达系统所用21对引物序列

引物名称	引物序列（5′→3′）
PnUGT34	Forward：GCGGTACCATGGAGAGAGAAATTCACATAG
PnUGT34	Reverse：GCCGAAGCTTCTATTTTTCAGAATTTTTTCCGG
PnUGT58	Forward：CGGGGTACCATGGAAAATAACCACGTTCT
PnUGT58	Reverse：CGGCGAATTCTTAACTCATCAATTGGGATTTC
PnUGT59	Forward：CGGGGTACCATGGAAAATAACCACGTTCT
PnUGT59	Reverse：CGGCGAATTCTTAACTCATCAATTGGGATTTC
PnUGT60	Forward：ATTGGTACCATGGCCAATGACAAATT
PnUGT60	Reverse：GCCGGGATCCTCATTTTGTGAGGATTTTATGAC
PnUGT63	Forward：GCGGGATCCATGGGTGACAAAACTTTTCA
PnUGT63	Reverse：ATTGTCGACTCATTGCAGGAGGCCAT
PnUGT65	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGTCCCAAAGTCCAGCAATGT
PnUGT65	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTATAGCTTTTCTTGATTGTTCTTCTGTT
PnUGT67	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGAGAAGCAAGGAGAAAAGAAA
PnUGT67	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTATAATGACATAATATAACTAACCAAGTTTTG
PnUGT73	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGATTCACCGTCAGACCAGC
PnUGT73	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATCAAATGATATGGCTAACTGAGTTTTG
PnUGT75	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGAGCAAAATCAGAAAATGGC
PnUGT75	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTATCTCCTAGAGAAAGATAAAATGCTAGC
PnUGT1	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGCAACCCAAAAATGTTTCC
PnUGT1	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATCATACAACAATCCGTTTTTTCTTG
PnUGT77	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGGAGCGGAGCTCATCTT
PnUGT77	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTAATTACCCATGACATCCTCAATAAA
PnUGT78	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGTCCGGTTCCTCCGGTAA
PnUGT78	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGACTATCGATCATTTTTGAGTTGAAGTTG
PnUGT79	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGACAACAGTTGAGGAAGTATTTGTG
PnUGT79	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATCATAATAACACCCCCCTAAAGGC
PnUGT80	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGGCTCCCTTCCTAAAGTAAC
PnUGT80	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGACTACTTTGATAACAACACCTGATCCA
PnUGT81	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGAATGCACCAAGTTTTCACATAG
PnUGT81	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATCATCCCAATAACTGTTGCAGTTT
PnUGT82	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGTCTTCCTCCATCTCTATATCTTCC
PnUGT82	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGACTATTTCCACTTAGCAATCAAATTGG
PnUGT83	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGATCAACCAGCAGCCC
PnUGT83	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTAGCTAGGCAAAACTATGGCCA
PnUGT85	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGGATTAAATTCAGCTAATAAGGC
PnUGT85	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATCACATATTGCAGTGGAGAGCTTC
PnUGT86	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGAGAAGAATCACTGTGACAACC
PnUGT86	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTATCTACGAATGTGAGCAATGAAGTC
PnUGT87	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGAACATGAAGATCAAAAGCC
PnUGT87	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTAATTATTTGCCGTTGGGCA
PnUGT88	Forward：ATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGGATCCGCCGATTTG
PnUGT88	Reverse：AGCAGAGATTACCTATCTAGATTAATGGATGTGGGATTCTGAAATA

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1.1.2 重组蛋白诱导表达实验相关材料

SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒、考马斯亮蓝染色液与脱色液，购自碧云天生物技术有限公司。实验室配制LB培养基（酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L）、氨苄青霉素（终浓度100 mg/L）。

1.1.3 体外酶促反应实验相关材料

9种黄酮类化合物由上海中药标准化研究中心提供，化学结构见图2及表2。使用时用二甲基亚砜（DMSO）溶解成20 mg/ml溶液。Tris-HCl溶液（pH 7.5，100 mmol/L）以及色谱级甲醇、正丁醇、乙腈和磷酸，均购自国药集团化学试剂有限公司。

图2 黄酮类化合物结构

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表2 黄酮类化合物取代基

黄酮类化合物	取代基
乔松素（Pinocembrin）	R₆-OH，R₈-OH，Rn-H
柚皮素（Naringenin）	R₅-OH，R₇-OH，R_4’-OH，Rn-H
杨梅素（Myricetin）	R₅-OH，R₇-OH，R₃-OH，R_3’-OH，R_4’-OH，R_5’-OH，Rn-H
槲皮素（Quercetin）	R₆-OH，R₈-OH，R₂-OH，R_4’-OH，R_5’-OH，Rn-H
山姜素（Alpinetin）	R₅-CH3，R₇-OH，Rn-H
山柰酚（Kaempferol）	R₃-OH，R₅-OH，R₇-OH，R_4’-OH，Rn-H
芹菜素（Apigenin）	R₅-OH，R₇-OH，R_4’-OH，Rn-H
黄芩素（Baicalein）	R_3’-OH，R_4’-OH，R_5’-OH，Rn-H
橙皮素（Hesperetin）	R₅-OH，R₇-OH，R_3’-OH，R_4’-OH，Rn-H

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1.1.4 主要仪器

Mastercycler pro Ptc-200 PCR仪，德国Eppendorf公司；电热恒温培养箱，美国Thermo Scientific公司；电热水浴锅，上海法润科学仪器有限公司；蓝光切胶仪，杭州杭研科技有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂；垂直电泳槽、往复式脱色摇床，美国Bio-Rad公司；Synergy H1全功能酶标仪，美国Bio Tek公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技有限公司；全自动样品浓缩仪，上海那艾仪器厂；1260高效液相色谱仪，美国Aglient公司；高效液相色谱柱（XBridge C₁₈色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Waters公司；Himac CR 22G高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；ZQZY-A振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司。

1.2 系统进化树构建与分析

将本研究所用的糖基转移酶与已报道的不同植物来源的黄酮糖基转移酶^[

12-16]一起构建系统进化树，并依据文献报道将进化树分支上的UGTs按照催化功能进行分类。共涉及43条糖基转移酶基因，包括21条三七来源的及22条其他植物来源的糖基转移酶基因。将43条基因的氨基酸序列输入MEGA7.0软件，步长检验值设定为1 000，以邻近树法建立系统发育树。

1.3 UGTs的分子克隆

PCR扩增目的片段，目的片段PCR产物胶回收；pCold载体双酶切并胶回收；利用同源重组酶将PCR产物胶回收片段与载体酶切回收片段于37℃下连接30 min；采用热激转化法将连接体系转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再将菌液均匀地涂布在含有相应抗生素的LB固体培养基平板上，于37℃电热恒温培养箱中倒置过夜，次日挑选单克隆。

对菌液样本，PCR鉴定阳性单克隆；PCR结果为阳性的菌液，提取质粒送至上海生工生物工程公司测序；测序结果正确的样本，按照热激转化法转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。测序引物为pCold载体的通用引物，正向引物序列（5′→3′）为GTAAAGCACGCCATATCGC，反向引物序列（5′→3′）为CCAAATGGCAGGGATCTTAG。PCR反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，引物Tm值较小者降低3～5℃退火30 s，72℃延伸90～110 s，72℃保育10 min；其中95℃变性到72℃延伸共循环30～35次。PCR反应条件：总体系10 μl，PCR模板0.5 μl，正反向引物各0.5 μl，2×PCR Mix 5 μl，去离子水3.5 μl。双酶切总体系（20 μl）：质粒或PCR胶回收产物10 μl，限制性核酸内切酶各1 μl，10×FastDigest Buffer 2 μl，去离子水6 μl。酶连体系（10 μl）：线性化载体（0.02×克隆载体碱基对数）ng，插入片段（0.04×插入片段碱基对数）ng，同源重组酶EXnaseⅡ1 μl，5×CE BufferⅡ2 μl，以去离子水补足反应体系至10 μl。

1.4 重组蛋白诱导表达及检测

取3 μl低温冻存的保种菌液BL21-pCold-UGTs，接种至3 ml LB培养基中（含100 mg/L氨苄青霉素），于37℃摇床振荡培养12～16 h。次日按1%接种量转移至50 ml含抗生素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养，直至检测菌液OD₆₀₀值在0.4～0.6；将其转移到冰水浴中诱导30 min，再转移到15℃摇床继续振荡培养20 h。低温超速离心，收集菌体细胞，以pH7.5的PBS清洗2次后，加入5 ml细胞裂解液（50 mmol/L pH 7.4 PBS，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，5%甘油），超声破碎后离心，取12 μl上清，加入3 μl 5×loading Buffer（上样缓冲液），混匀后100℃水浴加热3～5 min，使蛋白变性，上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析蛋白表达情况。

1.5 体外酶促反应

为提高反应产物检测效率，将21个糖基转移酶平分成7组，分别进行体外酶促反应，即UGT1、UGT34、UGT58为第1组，UGT59、UGT60、UGT63为第2组，UGT65、UGT67、UGT73为第3组，UGT75、UGT77、UGT78为第4组，UGT79、UGT80、UGT81为第5组，UGT82、UGT83、UGT85为第6组，UGT86、UGT87、UGT88为第7组。催化反应的总体系为400 μl，包括20 mg/ml黄酮类化合物2 μl，UDP-糖基供体8 μl，每一组粗酶液各100 μl，Tris-HCl溶液（pH 8.0）90 μl。于37℃恒温摇床孵育过夜，加入等体积水饱和正丁醇萃取2次；取正丁醇层至新的离心管，置于样品浓缩仪内挥干正丁醇；加200 μl甲醇复溶，0.22 μm滤膜过滤后，转移至高效液相色谱（HPLC）的检测小管中。检测到糖苷产物后，将混合酶拆分，保持其他反应条件不变，取粗酶100 μl进行体外酶促反应，同时以标准品和pCold空载体作对照。

1.6 HPLC检测反应产物

选用XBridge C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30℃。以0.4%磷酸水溶液（水相）－乙腈（有机相）为流动相，梯度洗脱条件为：0 min，5%有机相，95%水相；5 min，5%有机相，95%水相；30 min，100%有机相；35 min，100%有机相。根据混合重组酶的反应结果，将生成反应产物的实验组混合酶拆分，分别进行酶促反应以确定具有催化活性的重组酶。本研究中第6组混合酶（UGT82、UGT83、UGT85）检测到酶促反应产物，故拆分后分别进行酶促反应，再用HPLC检测反应产物。

2 结果

2.1 系统进化树分析结果

黄酮糖基转移酶的功能不同，体现在催化黄酮类化合物的糖基化位点不同，基于此共分为5类^[

12-16]。

FiF3GlcT为连翘来源的糖基转移酶，基因登录号为AAD21086.1；PfF3GlcT为紫苏来源的糖基转移酶，基因登录号为BAG31951.1；UGT78B1为龙胆来源的糖基转移酶，基因登录号为BAA12737.1；PhF3GlcT为矮牵牛来源的糖基转移酶，基因登录号为BAA89008.1；HvF3GT基因登录号为CAA33729.1。以上均参与催化3-O位的糖基化反应，故归为一类，即参与3-O位糖基化反应类（Group Ⅰ）。

UGT709A4既能催化3-O位，也能催化7-O位糖基化反应；CsUGT45主要催化7-O位，也能催化3’-O位和4’-O位糖基化反应；WsGT为睡莲来源的糖基转移酶，参与催化7-O位糖基化反应；UGT72B11主要催化7-O位糖基化反应，也能催化3-O位和3’-O位糖基化反应。以上归为一类，即参与7-O位糖基化反应类（Group Ⅱ）。

ScUGT1催化5-O位糖基化反应，与PnUGT82归为一类，即参与5-O位糖基化反应类（Group Ⅲ）。

GmIF7GlcT为大豆来源的糖基转移酶，基因登录号为NP＿001235161.1，参与催化7-O位糖基化反应；UGT707B1参与3-O位、7-O位糖基化；UGT71A15催化7-O位、3-O位、2’-O位糖基化；UGT90A7催化3-O位、7-O位、3’-O位糖基化；Lb7GlcT为枸杞来源的糖基转移酶，参与催化7-O位糖基化反应；SbUGT催化7-O位、3-O位糖基化反应；UGT73B1基因登录号为NC＿003075.1，催化7-O位糖基化反应；UGT73C6基因登录号为NP＿18127，催化7-O位、3-O位糖基化反应；UGT95A1催化3-O位、7-O位、3’-O位糖基化反应。以上归为一类（Group Ⅳ）。

UGT94D1为芝麻来源的糖基转移酶，基因登录号为BAF99027.1，催化2’-O位糖基化反应；UGT94B1为雏菊来源的糖基转移酶，基因登录号为BAD77944.1，以UDP-葡萄糖醛酸为糖基供体，催化2’-O位糖基化反应；UGT79B1以UDP-木糖为糖基供体，催化3-O位糖基化反应。以上归为一类（Group Ⅴ）。系统进化树如图3所示。

图3 三七中21条UGTs基因与类黄酮糖基转移酶基因的系统进化树

红色标注表示本研究涉及的21条UGTs，绿色背景标注表示体外酶促反应检测到黄酮糖苷产物的混合酶组

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2.2 蛋白表达情况

采用SDS-PAGE检测BL21 pGEX-4T-1-UGTs重组蛋白的表达情况，如图4所示。

图4 重组蛋白BL21-pGEX-4T-1-UGTs的SDS-PAGE电泳分析图

（A）和（B）为可溶性蛋白，（C）和（D）为非可溶性蛋白。（E）和（F）中同一重组蛋白左侧条带表示可溶性表达，右侧条带表示非可溶性表达。箭头表示目的蛋白，M表示蛋白marker，4T-1为阴性对照组。各图左侧的数值表示相对分子质量（kD）

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将BL21-pGEX-4T-1-UGTs重组蛋白表达情况汇总，见表3。21条重组蛋白中，仅UGT1、UGT67、UGT75 3个蛋白得到少量的可溶性表达，其他蛋白均不可溶或不表达。

表3 BL21-pGEX-4T-1-UGTs重组蛋白表达情况

糖基转移酶	可溶性表达	包涵体表达
UGT34	×	×
UGT58	×	√
UGT59	×	√
UGT60	×	√
UGT63	×	√
UGT65	×	√
UGT67	√	√
UGT73	×	√
UGT75	√	√
UGT1	√	√
UGT77	×	×
UGT78	×	×
UGT79	×	√
UGT80	×	×
UGT81	×	×
UGT82	×	√
UGT83	×	√
UGT85	×	×
UGT86	×	×
UGT87	×	√
UGT88	×	√

注： “√”表示“有”，“×”表示“无”

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BL21-pCold-UGTs重组酶的蛋白电泳结果如图5。结果表明，所有21条基因在pCold表达载体上均得到良好的可溶性表达，而在pGEX-4T-1表达载体上，21条糖基转移酶基因多以包涵体表达或不表达。

图5 BL21-pCold-UGTs重组酶的SDS-PAGE电泳分析图

M为蛋白Marker；pCold为阴性对照组，其蛋白的相对分子质量为54.4 kD；21条重组酶的相对分子质量约100 kD

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2.3 体外酶促反应结果

以山柰酚为底物的酶促反应，HPLC检测结果见图6。山柰酚7-O葡萄糖苷的标准品保留时间为15.440 min，而山柰酚与重组酶PnUGT82-pCold催化反应中产生的新的色谱峰保留时间为15.395 min，且紫外吸收峰特征相同，可以确定为同一种物质。阴性对照组pCold空白载体与山柰酚的反应中没有新的色谱峰出现，故确定PnUGT82能够催化山柰酚7位的葡萄糖基转移反应。

图6 PnUGT82催化山柰酚生成山柰酚7-O葡萄糖苷

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以芹菜素为底物的酶促反应，HPLC检测结果见图7。芹菜素7-O葡萄糖苷标准品与反应后新的色谱峰的保留时间分别是15.363 min和15.377 min，且紫外吸收特征相同，认为是同一种物质。阴性对照组pCold空白载体与芹菜素反应后没有新的色谱峰出现，故确定糖基转移酶PnUGT82也能够催化芹菜素7位葡萄糖基转移反应。

图7 PnUGT82催化芹菜素生成芹菜素7-O葡萄糖苷

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3 讨论

近年来，随着生物技术的发展，分子生物学、生物化学等多种技术被运用于UGT的克隆、鉴定和功能分析，越来越多的植物UGT家族得到分析报道，多数类黄酮糖基转移酶在拟南芥、葡萄、苹果、大豆、牡丹等模式植物、农作物或观赏性植物中得到鉴别^[

8，17-22]，但传统中药材中类黄酮UGT的鉴别研究相对较少。

随着合成生物学技术的发展，利用大肠杆菌或酵母细胞作为工厂合成黄酮糖苷或其他天然产物成为研究热点^[

22-25]。与分离纯化法、化学合成法相比，借助微生物转化合成类黄酮糖苷，反应条件温和，且具有区域选择性高^{[参考文献 26

百度学术

26]}以及所得产物纯度高、产量大等优点。将具有不同催化功能的UGT转入大肠杆菌或酵母细胞中，可催化合成多种多样的黄酮糖苷类化合物。如将拟南芥阿拉伯糖糖基转移酶AtUGT78D3在大肠杆菌中过量表达，以尿苷二磷酸阿拉伯糖为糖基供体，可大量合成槲皮素阿拉伯糖苷^{[参考文献 27

百度学术

27]}；在大肠杆菌中分别过量表达大豆GmUGT78K1和长春花CaUGT，可大量合成黄酮醇糖苷^{[参考文献 28

百度学术

28]}。

糖基转移酶催化生物体内糖基化反应，将糖基从活化的供体分子转移到受体分子上，从而形成各种各样的糖苷化合物。类黄酮糖基化主要由尿苷二磷酸糖基依赖的转移酶催化。不同的UGT具有不同的受体或底物多样性和特异性^[

29]。植物黄酮糖基转移酶的糖基受体包括黄酮醇、黄酮烷、花青素、黄酮、黄烷醇等苷元，这些黄酮苷元可被相同或不同的UGT催化生成相应的黄酮糖苷。而在糖基供体方面，UDP-葡萄糖是最常见的活化糖基供体分子；此外，UDP-槐糖、UDP-鼠李糖、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖、UDP-阿拉伯糖等也可被UGT利用生成对应的类黄酮糖苷。如有研究者从三七茎叶中分离得到槲皮素3-O槐糖苷、山柰酚3-O半乳糖苷、山柰酚7-O鼠李糖苷等成分^{[参考文献 2

百度学术

2]}，说明三七中含有相关的UGTs参与催化这些次生代谢产物的合成。但目前有关三七中类黄酮UGTs的研究鲜有报道。

本研究以来源于三七转录组、且功能注释为糖基转移酶的21条基因为对象，通过大肠杆菌表达重组蛋白，获得21条可溶性重组蛋白酶，并进行体外酶活性验证，结合系统进化树分析结果，成功筛选到1条黄酮糖基转移酶PnUGT82，其在体外将UDP-葡萄糖上的葡萄糖基团转移到山柰酚和芹菜素的7位羟基上，进而形成相应的黄酮糖苷。这为揭示三七中黄酮类次生代谢产物的生物合成途径奠定了一定基础。同时，在三七中发现的糖基转移酶基因UGT82也可作为生物合成山柰酚7-O葡萄糖苷或芹菜素7-O葡萄糖苷的候选基因。有趣的是，在系统进化树分析中，UGT82本身聚类在5-O糖苷化的分支上，而本实验发现其实际催化的是7-O糖苷化反应。这说明样本量较少时，聚类分析的结果可能与实际情况存在一定偏差。

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摘要

目的：,2,将前期克隆得到21条三七来源的糖基转移酶基因，构建到pCold表达载体，以实现重组蛋白的可溶性表达，并筛选、鉴定其在体外对黄酮类化合物的催化功能。,方法：,2,对21条糖基转移酶基因进行系统进化树分析；利用同源重组的方法将其克隆到pCold表达载体上，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。低温诱导重组蛋白表达，以黄酮类化合物为糖基受体底物，UDP-葡萄糖为糖基供体，采用高效液相色谱法（HPLC）检测酶促反应产物。,结果：,2,分别以山柰酚和芹菜素为底物，重组蛋白,Pn,UGT82参与反应后，可检测到山柰酚7-O葡萄糖苷和芹菜素7-O葡萄糖苷，而阴性对照组未检测到对应的糖苷产物。,结论：,2,筛选得到1条三七来源的糖基转移酶,Pn,UGT82，能够催化黄酮类化合物，在体外将UDP-葡萄糖上的葡萄糖基团转移到山柰酚或芹菜素7位羟基，形成相应的黄酮7-O糖苷化产物。

Abstract

Objective:,2,Twenty-one glycosyltransferase genes, cloned from Notoginseng Radix et Rhizoma in previous study, are separately constructed into pCold expression vector to realize the soluble expression of recombinant protein, and their catalytic function towards flavonoids ,in vitro, is screened and identified.,Methods:,2,Phylogenetic tree analysis was performed using 21 glycosyltransferase genes.These genes were separately cloned into pCold expression vector by homologous recombination, and the recombinant proteins were expressed in ,Escherichia coli.,The recombinant proteins were induced to express at low temperature.Taken flavonoids as glycosyl receptor substrates and UDP-glucose as glycosyl donor, the enzymatic reaction products were detected by high performance liquid chromatography(HPLC) .,Results:,2,Using kaempferol and apigenin as substrates respectively, kaempferol 7-O glucoside and apigenin 7-O glucoside could be detected after the recombinant protein ,Pn,UGT82 participated in the reaction; while the corresponding glycoside products were not detected in the negative control group.,Conclusion:,2,A glucosyltransferase ,Pn,UGT82 from Notoginseng Radix et Rhizoma is obtained, which can catalyze flavonoids.The glucosyl from UDP-glucose is transferred to the 7-hydroxyl of kaempferol or apigenin, to form the corresponding flavonoid 7-O glycoside products ,in vitro,.

关键词

三七黄酮糖基转移酶重组蛋白催化功能

Keywords

Notoginseng Radix et Rhizomaflavonoidglycosyltransferaserecombinant proteincatalytic activity

references

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