Processing math: 100%
切换中文
Your Location：
Home >
Browse articles >
Huangci Granules alleviate 5⁃FU induced cognitive impairment in mice through improving neuroregenerative damage and gliosis
Experiment Research | Updated：2022-08-29
|

    • Huangci Granules alleviate 5⁃FU induced cognitive impairment in mice through improving neuroregenerative damage and gliosis

    • WANG Jie

      ,  

      JIA Ru

      ,  

      MA Fuqi

      ,  

      RONG Wenqing

      ,  

      LI Jingru

      ,  

      FENG Qing

      ,  
    • Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine   Vol. 36, Issue S1, Pages: 124-129(2022)

    • DOI：10.16306/j.1008-861x.2022.S1.031    

      CLC：

    Scan for full text

  • Cite this article

    PDF

  • WANG Jie,JIA Ru,MA Fuqi,et al.Huangci Granules alleviate 5⁃FU induced cognitive impairment in mice through improving neuroregenerative damage and gliosis[J].Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,2022,36(S1):124-129. DOI： 10.16306/j.1008-861x.2022.S1.031.

  •  
    Sections

    Abstract

    Objective： To observe effect and mechanism of Huangci Granules on 5-fluorouracil （5-FU） induced cognitive impairment in mice.

    译

    Methods

    The mice were randomly divided into control group， model group （5-FU， 60 mg/kg）， low-dose Huangci Granules group （1.8 g/kg） and high-dose Huangci Granules group （5.4 g/kg）. The changes of motor ability and memory ability were observed by open field test and new and old objects recognition test. The neurogenesis and gliosis in the brain of mice were investigated by immunohistochemistry in each group.

    译

    Results

    ①There was no significant difference in the motor ability of mice in each group. ②Compared to the control group， the memory ability of the model mice decreased significantly （P<0.05）， and Huangci Granules could significantly improve the impairment of memory ability in mice （P<0.05）. ③Compared to the control group， the expression of Doublecortin （DCX） in the subgranule zone of the dentate gyrus and subventricular zone of the lateral ventricle decreased significantly in mice of the model group （P<0.05）， and both low dose and high dose Huangci Granules could significantly increase the expression of DCX （P<0.05）. ④Compared to the control group， microglia and astrocytes in the hippocampus of the model group significantly proliferated and activated （P<0.05）， and Huangci Granules could significantly reduce the proliferation and activation of microglia and astrocytes in the hippocampus （P<0.05）.

    译

    Conclusion

    Huangci Granules can alleviate 5-FU induced cognitive impairment in mice through improving nerve regeneration injury and gliosis.

    译

    近年来，恶性肿瘤发病率与病死率逐年攀升，成为威胁人类健康的主要疾病之一。目前化疗仍是其主要治疗手段，可显著改善预后，延长生存期。但化疗常常引起恶心呕吐、骨髓抑制、脱发等副作用，其中化疗相关认知功能障碍（chemotherapy-related cognitive impairment， CRCI）是非中枢神经系统癌症患者中常见的化疗副作用，严重影响患者生活质量。CRCI主要表现为注意力、记忆力和管理执行能力及处理生活事件的速度受损［

    1-2］ ，其发病率在13%~70%之间。CRCI病理机制十分复杂，至今尚未明确，目前认为神经再生受损、神经元凋亡、神经炎症、树突及树突棘减少、神经递质减少等均可导致CRCI［2-3］。其中，神经再生受损是CRCI发病的重要因素与干预环节［4-6］。结合对肿瘤“本虚标实”的病机认识，我科根据临床经验总结提出“补肾填精，解毒散结”法治疗大肠癌，且临床研究证实以其治法为指导的黄慈颗粒联合化疗可显著降低大肠癌术后转移率，改善患者认知功能损伤［7］，但其机制有待进一步阐明。本研究以5-FU诱导的认知功能障碍小鼠模型为研究对象，观察黄慈颗粒对模型小鼠脑内神经再生及胶质增生的影响，为临床应用提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1 实验动物

    8周龄C57/BL6J雄性小鼠，购自维通利华生物科技有限公司，许可证号为SCXK（上海）2017-0011。实验动物饲养于上海中医药大学实验动物中心，饲养条件为SPF级，每5只一笼，昼夜交替（12 h明，12 h暗）。室内温度保持在（22±2）℃，湿度维持在53 %~57 %，给予充足的饲料和水。所有动物实验方案均遵守实验动物管理和伦理规定，并通过实验动物伦理委员会审批（编号：PZSHUTCM200821019），且实验操作中尽量减少动物痛苦和不必要的死亡。

    1.1.2 药物和试剂

    中药（黄慈颗粒药物组成：地黄15 g、女贞子12 g、肉苁蓉9 g、山慈菇9 g、蛇莓9 g、八月札6 g），所有药材均购于上海中医药大学附属曙光医院中药房。加水煎煮二次，合并煎液，过滤，浓缩至一定相对密度的清膏，喷雾干燥，过筛，即得。

    5-FU（货号：F6627），DAB（货号：D8001）、多聚甲醛（货号：P6148），美国Sigma公司；双皮质素（doublecortin,DCX）抗体（货号：SC-271390），美国Santa Cruz公司；Iba-1（ionized calcium binding adaptor molecule 1）抗体（货号：019-19741），日本Wako公司；GFAP（glial fibrillary acidic protein）抗体（货号：ab7260），英国Abcam公司； Goat anti-Rabbit IgG （H+L） 二抗（货号：SF252549）、HRP-Streptavidin Conjugate（货号：TC265875）、Rabbit anti-Goat IgG （H+L） 二抗（货号：PA1-28663）、美国Invitrogen 公司；戊巴比妥钠（货号：SCRC69020181），国药集团化学试剂有限公司。

    1.1.3 主要仪器

    电子天平，上海精天电子仪器有限公司；数字显示PH计，德国Sartorius公司；磁力加热搅拌器，德国IKA公司；超纯水仪，德国Merck Millipore公司；冰冻切片机，德国Leica公司；显微镜，德国ZEISS公司；行为实验图像采集分析系统，荷兰Noldus公司。

    1.2 分组和干预

    将20只小鼠按体质量随机分为4组，每组5只，分别为对照组， 模型组（5-FU，60 mg/kg），低剂量组（5-FU+黄慈颗粒1.8 g/kg）和高剂量组（5-FU+黄慈颗粒5.4 g/kg）。小鼠适应性饲养7 d后，每日予以黄慈颗粒灌胃干预，于第14天开始予以腹腔注射5-FU，每隔3 d 1次，共注射4次，末次5-FU注射后第3天开始行为学实验，随后处死小鼠。对照组予以相应的生理盐水给药及腹腔注射。

    1.3 旷场实验及新旧事物识别实验

    新事物识别实验是利用小鼠先天对新物体有探索倾向的原理而建立的学习记忆测试方法［

    8］。实验分为适应期即旷场实验，训练期和测试期则为新旧事物识别实验。适应期将小鼠放入由长、宽、高分别为 50 cm×50 cm×50 cm的方形透明白板组成的试验箱中心位置，自由活动，并用监测系统记录分析小鼠5 min内的运动距离和移动速度。训练期在试验箱底部中央区域，放入两个颜色和形状完全一致的玩具（3 cm×4 cm）。将小鼠放入试验箱后自由活动5 min。测试期在训练期结束1 h后，用一个形状和颜色均不相同的新玩具代替其中一个玩具，再将小鼠放回盒内自由探索5 min。用监测系统记录其探索玩具的次数。小鼠对新事物的识别行为可以用认知指数（识别新事物的次数÷总识别的次数×100%）来评估其学习记忆能力。

    1.4 取材

    所有实验动物用戊巴比妥麻醉后进行心脏灌流并固定，脑取出后利用冰冻切片机连续切取厚度为30 μm的脑组织并将其储存在PBS溶液中备用，用于免疫组织化学染色。

    1.5 免疫组化

    各组小鼠的脑组织切片中挑选出对应脑区及大小适宜的脑片，经PBS漂洗后用0.03 %双氧水破膜，静置20 min。将组织用5 %的BSA封闭60 min。然后放入配置好的一抗中孵育24 h（DCX，1∶100；GFAP，1∶1000；Iba-1，1∶1 000）。一抗孵育结束后洗涤3遍，随后将脑组织放入对应二抗中孵育90 min。然后放入配置好的HRP溶液中，孵育90 min。DAB显色，染色均匀深度合适后取出贴片，55 ℃烘箱内烘干过夜。梯度脱水后用中性树胶封片，55 ℃烘箱中烘干以备拍照。

    1.6 统计学方法

    所有数据均使用 GraphPad Prism 9分析。实验数据均以ˉx±s表示。数据分析过程中，两组之间的比较使用Student’s test进行差异显著性分析；多个实验组比较使用one-way ANOVA进行分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

    2 结果

    2.1 对5⁃FU干预后小鼠运动能力和记忆能力的影响

    旷场实验提示各组小鼠在活动的总距离、平均速度均无统计学差异（见图1）。此外新旧事物实验提示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠训练后1 h的认知指数都明显下降（P<0.05），而黄慈颗粒给药组小鼠的认知指数都高于模型组小鼠（P<0.05）。上述结果表明，黄慈颗粒能够明显改善模型组小鼠因5-FU干预引起的学习记忆的损伤。

    2.2 对5-FU干预后小鼠海马齿状回颗粒下层（subgranule zone， SGZ）神经再生的影响

    利用DCX抗体标记了新生未成熟神经元以便观察小鼠脑内神经再生的情况。与对照组相比，模型组小鼠海马齿状回SGZ区DCX+的细胞数显著减少（P<0.05）；与模型组相比，低剂量和高剂量黄慈颗粒给药组小鼠海马齿状回SGZ DCX+的细胞数显著增多（P<0.05，P<0.05），且高剂量组小鼠SGZ区增加的DCX+细胞数明显比低剂量组多（P<0.05）。见图2。

    fig

    图2  各组小鼠运动能力和记忆能力指数比较（n=5，ˉx±s）

    A为各组小鼠移动的距离；B为各组小鼠移动的速度；C为各组小鼠的认知指数。与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05

    icon Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image
    fig

    图2  各组小鼠海马齿状回SGZ神经再生情况比较

    A为海马SGZ区DCX表达（免疫组化）；B为DCX阳性细胞数量（n=5，ˉx±s）。与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与低剂量组相比，△P<0.05

    icon Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image

    2.3 对5-FU干预后小鼠侧脑室室管膜下层（subventricular zone， SVZ）神经再生的影响

    与对照组相比，模型组小鼠侧脑室DCX阳性表达显著下降（P<0.05），而与模型组相比，低剂量和高剂量黄慈颗粒给药组小鼠侧脑室DCX阳性表达显著增多。见图3。

    fig

    图3  各组小鼠侧脑室SVZ神经再生情况比较

    A为小鼠侧脑室SVZ区DCX表达（免疫组化）；B为DCX相对表达量（n=5，ˉx±s）。与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05

    icon Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image

    2.4 对5-FU干预后小鼠海马CA1区小胶质细胞增殖及激活的影响

    用 Iba-1抗体标记了小鼠脑内小胶质细胞，观察各组中的小鼠海马 CA1 及 DG 区Iba-1 阳性小胶质细胞的增殖及激活情况。对照组小鼠的海马中Iba-1 阳性的小胶质细胞激活数目较少，且呈分叉状，而模型组小鼠的海马 CA1区中小胶质细胞明显激活，主要表现为胞体的增大和突起的增多，同时小胶质细胞的数量显著增多（P<0.05）。而与模型组相比，低剂量及高剂量黄慈颗粒给药组小鼠海马 CA1区中的小胶质细胞激活数目明显减少（P<0.05）。见图4。

    fig

    图4  各组小鼠海马CA1区小胶质细胞增殖及激活情况比较

    A为小鼠海马CA1区Iba-1表达（免疫组化）；B为Iba-1阳性细胞数（n=5，ˉx±s）。与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05

    icon Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image

    2.5 对5-FU干预后小鼠海马CA1区星形胶质细胞增殖及激活的影响

    用 GFAP 抗体标记了星形胶质细胞。与对照组小鼠相比，模型组小鼠海马CA1区中可以看到星形胶质细胞的明显激活，阳性细胞数显著增多（P<0.05）；与模型组相比，低剂量及高剂量黄慈颗粒给药组小鼠海马 CA1 区中的星形胶质细胞激活数目明显减少（P<0.05）。见图5。

    fig

    图5  各组小鼠海马CA1区星形胶质细胞增殖及激活情况比较

    A为小鼠海马CA1区GFAP表达（免疫组化）；B为GFAP阳性细胞数（n=5，ˉx±s）。与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05

    icon Download:  Full-size image | High-res image | Low-res image

    3 讨论

    传统中医学中并无CRCI的病名，其与《内经》中“善忘”“喜忘”、《诸病源候论》中的“多忘”以及《千金要方》中的“好忘”具有相似性，因而可将CRCI归属于“痴呆”类范畴。传统中医认为“肾生髓，脑为髓海”“肾”与脑功能存在密切的联系。《灵枢·海论》指出：“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”认为肾虚是痴呆发病的根本原因，“补肾填髓”法是防治痴呆有效治法。我们前期研究发现以“补肾填髓，解毒散结”治法为指导的黄慈颗粒能够降低大肠癌术后转移率的同时，还可显著改善患者的认知功能评分。这可能与其补肾填髓为主的治疗原则有着密切的联系。

    神经再生受损是CRCI发病的重要环节之一，因此本研究主要观察补肾填精法对5-FU诱导的认知功能障碍模型小鼠神经再生的影响。研究证实成年哺乳动物大脑中的侧脑室SVZ以及海马齿状回SGZ是内源性神经祖细胞（endogenous neural progenitor cells， eNPC）增殖的主要区域。而海马齿状回神经再生在包括记忆巩固在内的认知功能中都发挥着关键作用。新的神经细胞在哺乳动物的整个生命周期中都会发生，这种成体神经发生不管是在小鼠和人类脑内，都有助于大脑在整个生命周期中不断适应和做出改变［

    9-10］。在衰老的过程中神经再生逐渐减少导致学习和记忆功能下降，化疗药物能够加速生理衰老进程，许多研究已证实神经再生减少可导致CRCI的发生，缓解神经再生减少可改善CRCI［11］。例如，Sirichoat A等报道褪黑素可以通过促进海马齿状回SGZ区eNPC增殖改善甲氨蝶呤引起的认知功能损伤［12］。Winocur G等［13］报道运动锻炼能够促进海马齿状回SGZ区神经再生，从而改善5-FU引起的认知功能损伤。本研究结果显示黄慈颗粒能够显著改善5-FU诱导的海马齿状回SGZ和侧脑室SVZ神经再生的减少，为中医药防治CRCI提供了理论依据。

    此外，研究表明神经炎症、线粒体功能障碍均可引起神经再生受损。神经炎症指中枢神经系统内的一种炎症反应，可由多种因素引起，如促炎细胞因子白介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，以及趋化因子、小分子信使如前列腺素和一氧化氮以及中枢神经系统中固有免疫细胞产生的活性氧（ROS）［

    14］。参与这一过程的主要是脑内胶质细胞如小胶质细胞和星形胶质细胞为主。过度持续活化的小胶质细胞及星形胶质细胞能够释放大量的促炎因子和氧自由基，导致神经再生受损［15-16］。所以有效的抑制脑内小胶质细胞及星形胶质细胞的持续激活能够促进神经元的再生，也可能是治疗CRCI的一个至关重要的切入点。本实验结果显示，补肾填精法能够显著减少海马CA1区胶质细胞的增生和活化。

    综上所述，黄慈颗粒能够明显改善5-FU导致神经再生受损，并减少胶质细胞增生及活化，为中医药防治CRCI提供了理论依据，但其如何调控神经再生及胶质细胞活化的内在机制有待进一步探究。已有报道提出中药“补肾填髓”的现代生物学基础为促进神经元细胞能量代谢和利用，激活内源性神经营养因子生成，抑制神经毒素的生成，促进神经元存活与再生，最终改善认知功能损伤［

    17］。所以本课题组将从补肾中药促进神经元能量代谢和利用为出发点进行研究，以期为中医药防治CRCI提供理论基础并开拓其应用前景。

    参考文献

    1

    MILLER K D，NOGUEIRA L，MARIOTTO A B，et al.Cancer treatment and survivorship statistics， 2019［J］.CA Cancer J Clin， 2019， 69（5）： 363-385. [Baidu Scholar] 

    2

    DAS A，RANADIVE N，KINRA M，et al.An overview on chemotherapy-induced cognitive impairment and potential role of antidepressants［J］.Curr Neuropharmacol， 2020， 18（9）： 838-851. [Baidu Scholar] 

    3

    NGUYEN L D，EHRLICH B E.Cellular mechanisms and treatments for chemobrain： insight from aging and neurodegenerative diseases［J］.EMBO Mol Med，2020， 12（6）： e12075. [Baidu Scholar] 

    4

    SEKERES M J，BRADLEY-GARCIA M，MARTINEZ-CANABAL A，et al.Chemotherapy-induced cognitive impairment and hippocampal neurogenesis： a review of physiological mechanisms and interventions［J］.Int J Mol Sci，2021， 22（23）： 12697. [Baidu Scholar] 

    5

    RUNMMEL N G，CHAISWING L，BONDADA S，et al.Chemotherapy-induced cognitive impairment： focus on the intersection of oxidative stress and TNFalpha［J］.Cell Mol Life Sci， 2021， 78（19-20）： 6533-6540. [Baidu Scholar] 

    6

    SCHROYEN G，BLOMMAERT J，VAN W D，et al.Neuroinfla-mmation and its association with cognition， neuronal markers and peripheral inflammation after chemotherapy for breast cancer［J］.Cancers （Basel），2021， 13（16）： 4198. [Baidu Scholar] 

    7

    JIA R，LIU N，CAI G，et al.Effect of PRM1201 combined with adjuvant chemotherapy on preventing recurrence and metastasis of stage Ⅲ colon cancer： a randomized， double-blind， placebo-controlled clinical trial［J］.Front Oncol， 2021， 11： 618793. [Baidu Scholar] 

    8

    ENNACEUR A， DELACOUR J.A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1： behavioral data［J］.Behav Brain Res， 1988， 31（1）： 47-59. [Baidu Scholar] 

    9

    ANACKER C，HEN R.Adult hippocampal neurogenesis and cognitive flexibility-linking memory and mood［J］.Nat Rev Neurosci， 2017， 18（6）： 335-346. [Baidu Scholar] 

    10

    WALGRAVE H，BALUSU S，SNOECK S，et al.Restoring miR-132 expression rescues adult hippocampal neurogenesis and memory deficits in Alzheimer’s disease［J］.Cell Stem Cell， 2021， 28（10）： 1805-1821. [Baidu Scholar] 

    11

    NOKIA M S，ANDERSON M L，SHORS T J.Chemotherapy disrupts learning， neurogenesis and theta activity in the adult brain［J］.Eur J Neurosci， 2012， 36（11）： 3521-3530. [Baidu Scholar] 

    12

    SIRICHOAT A，KRUSRI S，SUWANNOKOT K，et al.Melatonin protects against methotrexate-induced memory deficit and hippocampal neurogenesis impairment in a rat model［J］.Biochem Pharmacol， 2019， 163： 225-233. [Baidu Scholar] 

    13

    WINOCUR G，WOJTOWICZ J M，HUANG J，et al.Physical exercise prevents suppression of hippocampal neurogenesis and reduces cognitive impairment in chemotherapy-treated rats［J］. Psychopharmacology（Berl）， 2014， 231（11）： 2311-2320. [Baidu Scholar] 

    14

    DISABOTO D J，QUAN N，GODBOUT J P.Neuroinflammation： the devil is in the details［J］.J Neurochem， 2016， 139： 136-153. [Baidu Scholar] 

    15

    MONJE M L， TODA H，PALMER T D.Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis［J］.Science， 2003， 302（5651）： 1760-1765. [Baidu Scholar] 

    16

    KWAK J H，KIM S，YU N K，et al.Loss of the neuronal genome organizer and transcription factor CTCF induces neuronal death and reactive gliosis in the anterior cingulate cortex［J］.Genes Brain Behav，2021， 20（2）： e12701. [Baidu Scholar] 

    17

    李林，魏海峰，张兰，等.中医“肾生髓，脑为髓海”现代生物学基础探讨［J］.中国中药杂志，2006， 17： 1397-1400. [Baidu Scholar] 

    61

    Views

    169

    Downloads

    0

    CSCD

    1

    CNKI Cited

    Alert me when the article has been cited
    Submit
    Tools
    Download
    Export Citation
    Share
    Add to favorites
    Add to my album

    Related Articles

    No data

    Related Author

    No data

    Related Institution

    No data
    0