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Study on Kang’ai injection regulating Beclin 1⁃dependent autophagy⁃apoptosis interaction and improving cisplatin resistance in A549/DDP cells
Discipline Frontiers | Updated：2022-08-29
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    • Study on Kang’ai injection regulating Beclin 1⁃dependent autophagy⁃apoptosis interaction and improving cisplatin resistance in A549/DDP cells

    • PAN Pengyu

      ,  

      ZHOU Huan

      ,  

      XU Ming

      ,  

      LIU Chunying

      ,  

      WANG Chun

      ,  
    • Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine   Vol. 36, Issue 4, Pages: 41-51(2022)

    • DOI：10.16306/j.1008-861x.2022.04.007    

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  • PAN Pengyu,ZHOU Huan,XU Ming,et al.Study on Kang’ai injection regulating Beclin 1⁃dependent autophagy⁃apoptosis interaction and improving cisplatin resistance in A549/DDP cells[J].Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,2022,36(04):41-51. DOI： 10.16306/j.1008-861x.2022.04.007.

  •  
    Sections

    Abstract

    Objective： To explore the molecular mechanism of Kang’ai injection reversing cisplatin resistance in human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP based on autophagy-apoptosis interaction protein Beclin 1.

    译

    Methods

    ①Kaplan-Meier Plotter online tool was used to analyze the relationship between Beclin 1 and suvival time of patients with lung cancer. ②The effects of cisplatin， Kang’ai and Kang’ai combined with cisplatin on the proliferation of A549 （cisplatin-sensitive parent cells） and A549/DDP （cisplatin-resistant cells） cells were analyzed by CCK-8 method.③The expression levels of autophagy-related proteins （Beclin1， ATG7， LC3） and apoptosis-related proteins （Bcl-2， Bax， cleaved caspase-3） were detected by Western blot.

    译

    Results

    ①The analysis of BECN1 mRNA expression level and clinicopathological indexes by Kaplan-Meier Plotter online tool showed that the survival time of BECN1 high expression group was significantly higher than that of BECN1 low expression group， and the expression level of BECN1 in lung adenocarcinoma tissues was positively correlated with the prognosis of patients （P<0.001）. ②The expression of Beclin 1 protein in A549/DDP cells was higher than that in A549 cells （P<0.05）. ③Compared with the control group， cisplatin upregulated the expression of Beclin 1， ATG7， LC3Ⅰ and LC3Ⅱ in A549 and A549/DDP cells （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. In A549 cells， the expression of Bax and cleaved caspase-3 increased （P<0.01，P<0.001）， the expression of Bcl-2 decreased （P<0.01） and the ratio of Bax/Bcl-2 increased （P<0.01） after cisplatin intervention. In A549/DDP cells， the expression of Bax and Bcl-2 increased （P<0.05，P<0.01）， but the ratio of Bax/Bcl-2 decreased （P<0.05） after cisplatin intervention. ④Compared with the cisplatin group， low， middle and high concentration of Kang’ai injection combined with cisplatin significantly inhibited the proliferation of A549/DDP cells （P<0.01， P<0.001）. The expression of Beclin1 decreased in cisplatin+low concentration Kang’ai group （P<0.001）， increased in cisplatin+medium and high concentration Kang’ai groups （P<0.001）， and cisplatin+high concentration Kang’ai group has the largest increase （P<0.001）. ⑤Compared with cisplatin group， low， middle and high concentration of Kang’ai injection combined with cisplatin could upregulate the expression of ATG7 （P<0.05， P<0.01）， LC3Ⅰ（P<0.01，P<0.001） and LC3Ⅱ （P<0.01， P<0.001）， which was positively correlated with the concentration of Kang’ai injection. The expression of Bax decreased in cisplatin+low concentration Kang’ai group （P<0.05）， and increased in cisplatin+middle and high concentration of Kang’ai groups （P<0.01）. The expression of Bcl-2 decreased in cisplatin+low and middle concentration Kang’ai groups （P<0.05）， and increased in cisplatin+high concentration Kang’ai group （P<0.05）. The expression of cleaved caspase-3 and Bax/Bcl-2 ratio increased in cisplatin+low， middle and high concentration Kang’ai groups （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. And there was a positive correlation between the expression of cleaved caspase-3 and the concentration of Kang’ai injection.

    译

    Conclusions

    Kang’ai injection can effectively improve the cisplatin resistance of A549/DDP cells. The mechanism may be that it can upregulate the expression of Beclin 1 protein and regulates the interaction between autophagy and apoptosis mediated by Beclin1， which leads to autophagic death and apoptosis of A549/DDP cells.

    译

    肺癌是我国最常见的呼吸系统恶性肿瘤，每年新发病例约70多万例，5年生存率仅为20%左右。肺癌中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占85%以上，发现时大部分患者已出现淋巴结和/或远处脏器转移，因此NSCLC的治疗多以传统的手术加化疗为主［

    1］。NSCLC的一线治疗方案常选用铂类药物为基础的联合化疗，但逐渐增加的铂类药物耐药性，不仅造成了患者对其他种类化疗药物敏感性降低，甚至还影响了肿瘤细胞对放疗的耐受性，严重阻碍了NSCLC的临床治疗［2］。因此，研究铂类药物耐药机制及寻找铂类药物增敏剂具有重要的应用价值和意义。

    自噬（autophagy）是广泛存在于细胞中的一种自身成分降解的过程，其活性变化调节着肿瘤的发生和发展。一方面，自噬可清除受损、衰老的细胞器，防止癌症发生；另一方面，有助于肿瘤细胞增加在营养缺乏、缺氧等不利环境下的适应能力，从而逃避凋亡等方式的死亡。但自噬是把双刃剑，过度自噬也可使细胞发生自噬性死亡［

    3］。BECN1基因在自噬过程中起着关键作用，其蛋白产物Beclin 1可与多种自噬相关蛋白结合形成核心复合体，促进吞噬泡募集和组装，激活自噬。研究发现，细胞自噬和凋亡之间存在着某种“切换开关”， 如Beclin1蛋白可作为“切换开关”调节自噬和凋亡间的相互作用，参与自噬与凋亡的调控［4］。因此，靶向Beclin1介导的自噬和凋亡间的互作，可能成为肿瘤治疗的新方向。

    康艾注射液是临床上常用的中药注射剂，由人参、黄芪、苦参素组成，多用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤及妇科恶性肿瘤的治疗［

    5］。研究表明，康艾注射液可有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人卵巢癌HO-8910细胞、小鼠结肠癌CT-26细胞、小鼠肺癌Lewis细胞等肿瘤细胞的增殖［6-7］，但康艾注射液是否具有化疗增敏作用，有待进一步研究。本研究靶向Beclin 1介导的自噬和凋亡间的互作机制，探究康艾注射液逆转人肺腺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的分子机制，以期为中西医结合改善肿瘤耐药性研究提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1 细胞

    人肺腺癌A549细胞、顺铂耐药的A549/DDP细胞，均购自中国医学科学院肿瘤研究中心。

    1.1.2 药物与试剂

    康艾注射液（货号：275464），长白山制药股份有限公司；顺铂（货号：PHR1624），德国Sigma公司；胎牛血清（FBS，货号：FB25015），美国Clark公司；二甲亚砜（DMSO，货号：DH105-2），北京鼎国昌盛生物科技有限公司；青霉素-链霉素（货号：SV30010），美国Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶（货号：25200-056），美国Gibco公司；McCoy’s 5A培养液（批号：WG210224C），北京中生奥邦生物科技有限公司； DMEM/F12培养液（批号：20210301），北京赛文创新生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒（货号：BCA-02），北京鼎国昌盛生物科技有限公司；Cell counting Kit-8（CCK-8）试剂盒（批号：092820210317）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（货号：P0012A）、RIPA裂解液（货号：P0013C），上海碧云天生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒（货号：1805001），上海天能科技有限公司；Bcl-2抗体（货号：ab32124）、Bax抗体（货号：ab32503）、cleaved caspase-3抗体（货号：ab32042）、β-actin抗体（货号：ab8226）、ATG7抗体（货号：ab215336），英国Abcam公司；LC3A/B抗体（货号：4108），美国Cell Signaling Technology公司；氟甲基酮（z-VAD-fmk，货号：HY-16658B）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA，货号：HY-19312），美国MedChemExpress公司。

    1.1.3 主要仪器

    Forma Steri-Cycle型CO2细胞培养箱、Megafuge 8R型台式多功能冷冻高速离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems型垂直蛋白电泳仪和蛋白转印装置，美国Bio-Rad公司；M200 PRO NanoQuant型全波段酶标仪，瑞士Tecan公司；AE2000型倒置显微镜，厦门Motic公司；Tanon-5200型全自动化学发光成像分析系统，上海天能科技有限公司。

    1.2 细胞培养

    A549细胞采用含10% FBS和100 U/ml青霉素-链霉素的DMEM/F12培养；A549/DDP细胞采用含10% FBS和100 U/ml青霉素-链霉素的McCoy’s 5A培养液。两细胞于37 ℃、95%湿度、5% CO2条件下培养。A549/DDP细胞一直在含1 μmol/L顺铂的培养液中培养以保持其顺铂耐药性，并于实验前2周更换为无顺铂的培养液［

    8］。

    1.3 分组与干预

    1.3.1 干预细胞活力

    ①顺铂耐药指数（resistant index，RI）实验：A549或A549/DDP细胞（4 000个/孔）接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分为不同浓度（0、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L）顺铂干预组，加入相应浓度顺铂干预24 h；②康艾注射液干预实验：A549/DDP细胞（4 000个/孔）接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分为不同浓度（0、4、8、16、32、64 g/L）康艾注射液干预组，加入相应浓度药物干预 26 h；③康艾注射液联合顺铂干预实验：A549/DDP细胞（4 000个/孔）接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分为康艾注射液的IC10、IC20、IC30联合不同浓度（0、4、8、16、32、64 μmol/L）顺铂组，或顺铂（10 μmol/L，相当于顺铂耐药指数实验中获得的A549细胞IC50）+低、中、高浓度（15、25、50 g/L，分别相当于康艾注射液的IC10、IC20、IC30）康艾注射液组，加入相应浓度康艾注射液预干预2 h后，再加入相应浓度顺铂联合干预24 h。干预后，各组分别检测细胞活力。

    1.3.2 干预自噬和凋亡相关蛋白的表达

    ①顺铂干预实验：分为A549对照组、A549顺铂组、A549/DDP对照组和A549/DDP顺铂组，用10 μmol/L顺铂分别干预A549和A549/DDP细胞；②康艾注射液联合顺铂干预实验：分为对照组、顺铂组、顺铂+低浓度（IC10）康艾组、顺铂+中浓度（IC20）康艾组、顺铂+高浓度（IC30）康艾组，分别用不同浓度康艾注射液联合顺铂（10 μmol/L）干预A549/DDP细胞。

    1.3.3 自噬与凋亡抑制剂实验

    ①自噬抑制剂实验：分为对照组、顺铂+3-MA组、顺铂+康艾高浓度组、顺铂+康艾高浓度+3-MA组；②凋亡抑制剂实验：分为对照组、顺铂+z-VAD-fmk组、顺铂+康艾高浓度组、顺铂+康艾高浓度+z-VAD-fmk组。用自噬抑制剂3-MA或凋亡抑制剂z-VAD-fmk预处理A549/DDP细胞3 h后，用10 mmol/L顺铂单独或联合高浓度（50 g/L）康艾注射液干预24 h，检测细胞活力。

    1.4 肺腺癌患者生存分析

    利用Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/）在线生存分析工具对GEO、EGA和TCGA数据库中的肺腺癌患者相关统计数据进行均一化处理，评估肺腺癌患者BECN1 mRNA表达水平与生存期的相关性。将Beclin 1输入到在线工具中，从Kaplan-Meier Plotter生成的结果中得到生存曲线图像，依据图像中的危险比（HR）、95%置信区间（CI）和P值对肺腺癌患者做平均生存期（月）的相关性分析。

    1.5 检测指标与方法

    1.5.1 CCK⁃8法检测RI和细胞活力

    按“1.3.1”项进行分组与干预，按照CCK-8试剂盒说明加入CCK-8溶液，继续孵育2 h，于450 nm处测定吸光度（OD），并进行计算。

    顺铂RI实验：通过量效曲线计算IC50，并计算RI，RI=（A549/DDP细胞顺铂IC50）/A549细胞顺铂IC50。获得的A549细胞顺铂IC50取整数值（10 μmol/L）用于后续药物联合干预实验。

    康艾注射液单独或联合顺铂干预实验：计算细胞存活率，细胞存活率（%）=［实验组OD-空白组OD］/（对照组OD-空白组OD）×100%。并计算康艾注射液的IC10、IC20和IC30。

    自噬与凋亡抑制剂实验：计算细胞抑制率，细胞抑制率（%）=（对照组OD-实验组OD）/（对照组OD-空白组OD）×100%。

    1.5.2 Western blot法检测自噬及凋亡相关蛋白的表达

    待A549或A549/DDP细胞密度达70%~80%时，按“1.3.2”项进行分组与干预，24 h后收集细胞于RIPA缓冲液中冰浴、摇床裂解15 min，提取每组细胞总蛋白，BCA法测定细胞的蛋白含量，分别经10%~15% SDS-PAGE电泳湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗（Beclin 1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、LC3）和二抗孵育，ECL化学发光试剂盒标记，成像分析系统曝光分析图片。

    1.6 统计学方法

    采用GraphPad Prism 9软件处理数据，计量资料以ˉx±s表示，两组间比较采用独立样本t检验（数据符合正态分布且方差齐）或Welch’s t检验（数据符合正态分布、方差不齐）；多组间比较采用应用one-way ANOVA（数据符合正态分布且方差齐）或Welch ANOVA（数据符合正态分布、方差不齐）分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

    2 结果

    2.1 BECN1 mRNA表达水平与临床病理学指标分析

    利用Kaplan-Meier Plotter在线分析工具（https：//kmplot.com/analysis/），从其中涵盖GEO、EGA和TCGA的数据库中生成719名肺腺癌患者的BECN1 mRNA表达水平数据和与生存信息相关联的资料，根据BECN1 mRNA表达水平中位数将患者分成BECN1高表达组（n=435）和BECN1低表达组（n=284）。结果显示，BECN1高表达组患者平均生存期约为126个月，而BECN1低表达组患者平均生存期为68个月。进一步分析患者生存期与BECN1 mRNA表达水平的相关性，结果显示BECN1 mRNA表达水平在肺腺癌组织中与患者预后呈显著正相关（HR=0.58，95%；CI=0.46~0.73；P<0.001）。见图1。

    fig

    图1  BECN1 mRNA表达水平与患者生存率之间的相关性分析

    红色曲线为BECN1 mRNA高表达组（n=435），黑色曲线为BECN1 mRNA低表达组（n=284）

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    2.2 RI程度不同的肺腺癌细胞Beclin 1表达水平的比较

    光镜下，A549细胞形状多呈卵圆形，细胞排列为相对整齐的“铺路石”样；A549/DDP细胞多呈长梭形或多角形，有较多的片状伪足和丝状伪足，且细胞排列不规则，见图2 A。用不同浓度的顺铂分别干预A549和A549/DDP细胞，做出抑制率拟合曲线后分析得出IC50分别为9.35 μmol/L和26.94 μmol/L，RI为2.88，见图2 B。进一步分析Beclin 1蛋白表达水平与顺铂耐药间的关系，结果显示顺铂耐药的A549/DDP细胞比亲本A549细胞的Beclin 1表达水平更高（P<0.05），见图2 C。

    fig

    图2  A549和A549/DDP细胞形态、耐药程度及Beclin 1蛋白表达的比较（n=3，ˉx±s）

    A为光镜下观察A549和A549/DDP细胞的形态（×200）；B为顺铂对A549和A549/DDP细胞存活率的影响；C为A549与A549/DDP细胞Beclin 1蛋白表达水平。与A549组比较，*P<0.05

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    2.3 顺铂对耐药程度不同的肺腺癌细胞Beclin 1表达的影响

    用10 μmol/L（接近A549细胞顺铂IC50）顺铂分别干预A549和A549/DDP细胞，结果显示Beclin 1表达水平均明显升高（P<0.001）。见图3。

    fig

    图3  各组A549和A549/DDP细胞Beclin 1蛋白的表达（n=3，ˉx±s）

    与对照组（顺铂-）比较，***P<0.001

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    2.4 顺铂对耐药程度不同的肺腺癌细胞自噬与凋亡的影响

    用10 μmol/L顺铂分别干预A549和A549/DDP细胞。结果显示，与对照组比较，两种细胞中自噬相关蛋白ATG7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的表达均显著增加（P<0.05，P<0.01），表明顺铂可激活A549和A549/DDP细胞自噬。见图4 A。

    fig

    图4  各组A549和A549/DDP细胞自噬和凋亡相关蛋白表达比较（n=3，ˉx±s）

    A为自噬相关蛋白表达； B为凋亡相关蛋白表达。与对照组（顺铂-）比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

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    观察顺铂干预下A549和A549/DDP细胞凋亡相关蛋白水平的变化情况。结果显示，顺铂干预后A549细胞中Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平升高（P<0.01，P<0.001），Bcl-2 蛋白表达水平降低（P<0.01），表明顺铂可诱导A549细胞凋亡。对于A549/DDP细胞，顺铂干预后Bax和Bcl-2 蛋白表达水平显著上调（P<0.05，P<0.01），cleaved caspase-3蛋白表达亦上调，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图4 B。

    进一步比较顺铂干预下A549与A549/DDP细胞Bax及Bcl-2蛋白比值（Bax/Bcl-2）的变化。以无顺铂干预时两种细胞的Bax/Bcl-2=1，结果显示顺铂干预下A549细胞中Bax/Bcl-2>1（P<0.01），而A549/DDP细胞中Bax/Bcl-2<1（P<0.05）。结果表明与A549细胞比较，A549/DDP细胞在10 μmol/L顺铂诱导下并没有发生凋亡，而是发生了凋亡抵抗。见图5。

    fig

    图5  各组A549和A549/DDP细胞Bax/Bcl⁃2比值（n=3，ˉx±s）

    与对照组（顺铂-）比较，*P<0.05，**P<0.01

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    上述结果提示，10 μmol/L顺铂干预可激活A549和A549/DDP细胞自噬。在顺铂敏感的亲本A549细胞中，自噬激活的同时可诱导细胞凋亡；但在顺铂耐药的A549/DDP细胞中，自噬激活的同时却伴随着凋亡抵抗。

    2.5 康艾注射液联合顺铂对A549/DDP细胞增殖活性、Beclin1表达的影响

    不同浓度康艾注射液可有效抑制顺铂耐药A549/DDP细胞的增殖活性（IC50=100.07 g/L），并表现出剂量依赖性。与顺铂组比较，低、中、高浓度康艾联合顺铂组均能降低A549/DDP细胞存活率（P<0.01，P<0.001）。见图6A。

    fig

    图6  各组A549/DDP细胞增殖活性及Beclin 1蛋白表达比较（n=3，ˉx±s）

    A为对A549/DDP细胞增殖活性的影响；B为对A549/DDP细胞Beclin1表达的影响。与顺铂组比较，**P<0.01，***P<0.001

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    与顺铂组比较，顺铂+低浓度康艾组能下调Beclin 1蛋白表达（P<0.001），而顺铂+中、高浓度康艾组则上调Beclin 1蛋白表达（P<0.001）。见图6B。

    2.6 康艾注射液联合顺铂对肺腺癌耐药细胞自噬、凋亡水平的影响

    进一步探索康艾注射液联合顺铂抑制A549/DDP细胞增殖的分子机制。结果显示，与顺铂组比较，联合用药组中自噬相关蛋白ATG7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表达均显著增加（P<0.05，P<0.01， P<0.001），并与康艾注射液的浓度升高呈正相关。见图7A。表明康艾注射液联合顺铂可进一步上调A549/DDP细胞自噬水平。

    fig

    图7  各组A549/DDP细胞自噬相关蛋白表达及细胞抑制率比较（n=3，ˉx±s）

    A为对自噬相关蛋白表达影响；B为自噬抑制剂对顺铂联合康艾注射液作用下自噬的影响。与顺铂组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与顺铂+康艾组比较，#P<0.05；与顺铂+3-MA组比较，△△△P<0.001

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    自噬抑制剂实验结果显示，与顺铂+康艾高浓度组比较，顺铂+康艾高浓度+3-MA组对A549/DDP细胞的抑制率下降（P<0.05），表明采用3-MA抑制自噬通路可有效阻断联合用药诱导的细胞自噬性死亡；与顺铂+3-MA组比较，顺铂+康艾高浓度+3-MA组A549/DDP细胞抑制率明显升高（P<0.001）。见图7B。提示康艾注射液联合顺铂诱导的A549/DDP细胞自噬性死亡过程中，还可能有其他的细胞死亡方式参与其中。

    进一步观察康艾注射液联合顺铂干预后A549/DDP细胞凋亡相关蛋白的变化。结果显示，与顺铂组比较，顺铂+康艾低度组Bax表达水平略有下降（P<0.05）；随着康艾浓度升高，Bax表达水平在顺铂+康艾中、高浓度组中表达水平逐渐升高（P<0.01）。与顺铂组比较，Bcl-2表达在顺铂+康艾低、中浓度组中降低（P<0.05），但在顺铂+康艾高浓度组中增加（P<0.05）。因为在Bcl-2家族中，Bax与Bcl-2蛋白表达的比值平衡决定了细胞的生死［

    9］，所以进一步分析康艾联合顺铂干预A549/DDP细胞Bax/Bcl-2比值的变化。结果显示，与顺铂组比较，顺铂+康艾低、中、高浓度组Bax/Bcl-2比值均增加（P<0.05，P<0.001），表现为促凋亡作用；且顺铂+康艾中浓度组促凋亡作用最为明显。此外，与顺铂组比较，cleaved caspase-3表达水平在顺铂+康艾低、中、高浓度组中逐渐增加（P<0.05，P<0.01），与康艾注射液浓度升高呈正相关。以上结果表明，相对于低浓度顺铂干预耐药细胞发生的凋亡抵抗，康艾注射液联合顺铂具有明显诱导耐药细胞发生凋亡的作用。见图8A。

    fig

    图8  各组A549/DDP细胞凋亡相关蛋白表达及细胞抑制率比较（n=3，ˉx±s）

    A为凋亡相关蛋白的表达；B为凋亡抑制剂对顺铂联合康艾注射液作用下凋亡的影响。与顺铂组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与顺铂+康艾高浓度组比较，#P<0.05；与顺铂+z-VAD-fmk组比较，△△P<0.01

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    凋亡抑制剂实验结果显示，与顺铂+康艾高浓度组比较，顺铂+康艾高浓度+z-VAD-fmk组对A549/DDP细胞的抑制率下降（P<0.05），表明采用z-VAD-fmk抑制凋亡通路可有效阻断联合用药诱导的细胞凋亡（P<0.05）；与顺铂+z-VAD-fmk组比较，顺铂+康艾高浓度+z-VAD-fmk组A549/DDP细胞抑制率明显升高（P<0.01）。见图8B。结合自噬抑制剂实验结果，进一步提示康艾注射液联合顺铂诱导的A549/DDP细胞自噬性死亡过程中，还伴随着细胞凋亡的发生。

    3 讨论

    BECN1被认为是哺乳动物体内调节自噬的核心基因之一，其蛋白产物Beclin 1可与多种自噬相关蛋白结合，形成自噬核心复合体，诱导自噬的发生［

    10］。最初的研究认为，BECN1是一种抑癌基因，对肿瘤的发生、发展起到抑制作用，如口腔舌鳞癌中Beclin 1低表达，表现为肿瘤分化不良、淋巴结转移、高TNM分期、5年生存率低［11］；肝癌组织中Beclin 1低表达，患者总体生存率低［12］。但也有研究指出，Beclin 1可能在不同的肿瘤组织中扮演着不同角色，如肝内胆管癌患者Beclin 1高表达与不良预后相关［13］。近年来，陆续报道了Beclin 1表达水平与NSCLC相关性研究，2018年的一篇meta分析报告中指出：Beclin 1蛋白在NSCLC中的表达水平低于癌旁组织，Beclin 1高表达者肿瘤临床病理分型低、淋巴结转移数目少、TNM分期低［14］。本研究进一步对肺腺癌患者BECN1 mRNA表达水平与患者生存情况进行相关性分析，结果显示肺腺癌组织中BECN1表达水平与患者生存期呈正相关。上述研究表明，BECN1 mRNA表达水平与NSCLC肿瘤分化程度、TNM分期及生存率有关；BECN1是NSCLC的抑癌基因，BECN1基因及Beclin 1蛋白表达水平可作为NSCLC预后的生物标志物。

    肿瘤耐药分子机制复杂，主要涉及药物外排增多、DNA损伤修复增强、凋亡抵抗、细胞保护性自噬以及表观遗传学调节等［

    15］。自噬的双刃剑作用使之在肿瘤发生、发展的不同阶段表现出双向性［16］。一方面，某些化疗药物如顺铂、紫杉醇等对肿瘤细胞核内DNA的损伤、抑制肿瘤血管生长造成的缺氧微环境等作用，可激活肿瘤细胞保护性自噬，促进细胞存活，产生耐药性；另一方面，自噬作为程序性死亡机制，过度激活将会直接导致耐药肿瘤细胞的死亡［15］。研究表明，耐药的肿瘤细胞往往拥有较高的基础自噬水平［17］，且自噬相关蛋白Beclin 1的表达水平与肿瘤的化疗抵抗密切相关［18］。本研究比较了顺铂耐药的人肺腺癌A549/DDP细胞与其亲本A549细胞（顺铂敏感细胞）的Beclin 1表达水平，结果显示顺铂耐药的A549/DDP细胞Beclin 1表达水平更高，且顺铂干预可激活顺铂敏感及顺铂耐药的A549细胞发生Beclin 1依赖性自噬。基于Beclin 1蛋白在自噬-凋亡互作中的调控作用，进一步研究自噬激活同时细胞凋亡水平的变化。结果提示，对于耐药程度不同的A549细胞，化疗药物均可激活细胞自噬；对于基础自噬水平较低的化疗敏感型A549细胞，化疗药物激活自噬激活的同时诱导了细胞凋亡；对于基础自噬水平较高的化疗抵抗型细胞，化疗药物激活自噬的同时却伴随着凋亡抵抗。

    为什么化疗药物干预基础自噬水平不同的A549细胞，在激活自噬的同时会出现诱导凋亡和凋亡抵抗两种不同的结局？一个重要的原因在于——凋亡（Ⅰ型程序性细胞死亡）与自噬（Ⅱ型程序性细胞死亡）之间存在信号通路的交叉及调控因子的交联。Beclin 1是自噬与凋亡双向调控蛋白，参与调控自噬与凋亡的互作。Beclin 1蛋白由进化保守结构域（evolutionarily conserved domain，ECD）、Bcl-2结合结构域（Bcl-2-homology-3，BH3）及卷曲螺旋结构域（coiled-coil domain，CCD）3个重要的结构域组成。这些结构域与不同的自噬/凋亡相关蛋白结合，决定了自噬-凋亡的“开”与“关”，如自噬调控蛋白（Atgs、VPS34等）与Beclin 1的不同结构域结合，形成蛋白复合体，调控自噬水平；凋亡抑制因子Bcl-2与Beclin 1的BH3结构域结合，使Bcl-2与促凋亡蛋白Bax解离，从而抑制自噬、激活凋亡［

    19］。Beclin 1蛋白调控细胞凋亡还与caspase蛋白酶的水解功能相关，Beclin 1是caspase的一种底物，可被活化的caspase蛋白酶剪切成N-端和C-端两个蛋白片段，从而失去自噬调控活性。水解后的C-端片段通过促进线粒体释放促凋亡基因，具有加速细胞凋亡的作用；水解后N-端片段（含BH3结构域）通过与Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白结合，抑制抗凋亡作用的丧失［20］。因此，Beclin 1调控的自噬-凋亡互作在肿瘤的治疗中起着关键作用，目前已发现某些非编码RNA、多肽可通过调控“Beclin 1介导的自噬通路”和“Beclin 1/Bcl-2复合物介导的凋亡”间的平衡，促进肿瘤细胞死亡、改善肿瘤细胞耐药性［21-22］。

    以化疗为基础的内科综合治疗是肿瘤控制的重要手段，中药复方、中药注射液辅助化疗的治疗手段有效改善了肿瘤患者的生存质量、延长了患者的生存时间。据报道，补中益气汤通过诱导细胞凋亡及自噬性死亡，有效改善肺腺癌A549/DDP细胞的顺铂耐药性［

    23］；肺积宁方通过上调肺癌细胞自噬，诱导细胞凋亡而发挥抗癌作用［24］。康艾注射液由黄芪、人参、苦参素组成，具有益气扶正的功效，能减轻化疗引起的不良反应，提高化疗治疗的效果，及增强机体免疫。研究表明，康艾注射液抗肿瘤机制可能涉及细胞凋亡、细胞周期、细胞自噬、细胞代谢、炎症反应等方面的调控作用［25-27］。本研究发现，康艾注射液联合顺铂干预顺铂耐药的A549/DDP细胞，通过上调Beclin 1蛋白表达，增加自噬相关蛋白ATG7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表达水平、上调凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值及caspase-3活性片段表达，诱导顺铂耐药的NSCLC细胞凋亡及自噬性死亡，有效改善NSCLC细胞的顺铂耐药性。其机制可能与康艾注射液联合顺铂调控了Beclin 1介导的自噬与Beclin 1/Bcl-2复合物介导的凋亡间的平衡，改善耐药细胞凋亡抵抗状态，诱导细胞发生自噬性细胞死亡及细胞凋亡有关。康艾注射液的主要化学成分包含人参皂苷、黄芪甲苷、氧化苦参碱等，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞周期阻滞、促进肿瘤细胞凋亡的作用［28-31］，康艾注射液联合顺铂诱导细胞发生自噬性死亡和凋亡，改善NSCLC顺铂耐药性，可能与上述康艾注射液有效成分的抗肿瘤机制有关。

    综上所述，康艾注射液能改善NSCLC细胞的顺铂耐药性、诱导肿瘤细胞死亡，其机制与进一步上调耐药细胞自噬水平，调节Beclin 1依赖的自噬-凋亡相互作用，诱导细胞自噬性死亡及细胞凋亡相关。康艾注射液抗肿瘤机制的研究可为中西医结合治疗恶性肿瘤提供实验依据，进一步扩大中药复方注射液在临床抗肿瘤中的应用，为肿瘤治疗提供新的思路和方法。

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    Department of Oncology， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
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