Study on inhibitory effect of celastrol on migration and invasion of non-small cell lung cancer and its molecular mechanism

Kaili LIN; Qiudi DENG; Xueping LEI

doi:10.16306/j.1008-861x.2022.02.008

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Study on inhibitory effect of celastrol on migration and invasion of non-small cell lung cancer and its molecular mechanism

Experiment Research | Updated：2022-08-29

- Study on inhibitory effect of celastrol on migration and invasion of non-small cell lung cancer and its molecular mechanism
- role： First author , 第一作者 ,
  
  Affiliation：
  Department of Preventive Medicine， School of Public Health， Guangzhou Medical University， Guangzhou 511436， Guangdong， China
  
  Email：
  
  Introduction：林凯莉，女，博士，讲师，主要从事中药抗肿瘤、神经毒理及神经药理研究
  
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  LIN Kaili
  ,
  role：
  
  Affiliation：
  GMU-GIBH Joint School of Life Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou 511436， Guangdong，China
  
  Email：
  
  No information about the author is available
  DENG Qiudi
  ,
  role： Corresponding author , 通讯作者 ,
  
  Affiliation：
  Key Laboratory of Molecular Target & Clinical Pharmacology， School of Pharmaceutical Sciences， Guangzhou Medical University， Guangzhou 511436， Guangdong， China.
  
  Email： xuepinglei@foxmail.com
  
  Introduction：雷雪萍，副研究员；E-mail：xuepinglei@foxmail.com
  
  No information about the author is available
  LEI Xueping
  ,
- Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Vol. 36, Issue 2, Pages: 43-48(2022)
- Affiliations：
  
  1.Department of Preventive Medicine， School of Public Health， Guangzhou Medical University， Guangzhou 511436， Guangdong， China
  2.GMU-GIBH Joint School of Life Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou 511436， Guangdong，China
  3.Key Laboratory of Molecular Target & Clinical Pharmacology， School of Pharmaceutical Sciences， Guangzhou Medical University， Guangzhou 511436， Guangdong， China.
- Author bio：
- Funds：
- DOI：10.16306/j.1008-861x.2022.02.008
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林凯莉,邓秋狄,雷雪萍.雷公藤红素抑制非小细胞肺癌迁移和侵袭的作用及其分子机制研究[J].上海中医药大学学报,2022,36(02):43-48.

LIN Kaili,DENG Qiudi,LEI Xueping.Study on inhibitory effect of celastrol on migration and invasion of non-small cell lung cancer and its molecular mechanism[J].Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,2022,36(02):43-48.
林凯莉,邓秋狄,雷雪萍.雷公藤红素抑制非小细胞肺癌迁移和侵袭的作用及其分子机制研究[J].上海中医药大学学报,2022,36(02):43-48. DOI： 10.16306/j.1008-861x.2022.02.008.

LIN Kaili,DENG Qiudi,LEI Xueping.Study on inhibitory effect of celastrol on migration and invasion of non-small cell lung cancer and its molecular mechanism[J].Academic Journal of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,2022,36(02):43-48. DOI： 10.16306/j.1008-861x.2022.02.008.

Sections

Abstract

Objective： To investigate the effects of celastrol on the migration and invasion of non-small lung cancer NCI-H1299 cells and explore its preliminary mechanism.

译

Methods

CCK-8 assay was used to detect the effect of celastrol on the proliferation of NCI-H1299 cells， and non-toxic concentration was obtained. Wound healing assay and transwell migration assay were used to evaluate the effect of celastrol on the migration ability of NCI-H1299 cells. Transwell invasion assay was used to detect the effect of celastrol on the invasion ability of NCI-H1299 cells. Western blot and quantitative real-time PCR assays were conducted to detect the effect of celastrol on the expressions of mesenchymal markers N-Cadherin， Vimentin， Snail， Slug and epithelial markers E-Cadherin and ZO-1 in NCI-H1299 cells.

译

Results

Celastrol inhibited the proliferation of NCI-H1299 cells in a dose-dependent manner， and had no significant effect on the proliferation at a concentration lower than 2.5 µmol/L. Celastrol inhibited the migration and invasion of NCI-H1299 cells at the concentration of 0.5 µmol/L， 1.0 µmol/L and 2.0 µmol/L. The results of western blot and quantitative real time PCR assays showed that celastrol promoted epithelial markers， inhibited the expressions of mesenchymal markers N-cadherin， Vimentin， Snail and Slug， up-regulated the expressions of E-cadherin and ZO-1 protein.

译

Conclusion

Celastrol can significantly inhibit the migration and invasion ability of NCI-H1299 cells， and this effect may be related to its reversal of epithelial mesenchymal transition （EMT） of NCI-H1299 cells.

译

KEYWOEDS　celastrol； non-small cell lung cancer； migration； invasion； epithelial mesenchymal transition.

译

肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的80%左右，包括鳞状细胞癌（鳞癌）、腺癌和大细胞癌^［

1］。NSCLC早期发病无明显的症状，约75%NSCLC患者首诊时已处于中晚期，这为其治疗带来极大的挑战。近年来，手术治疗、EGFR的靶向治疗与免疫疗法等治疗手段有了明显的提高，但NSCLC患者的生存率仍低于15%。转移被认为是导致NSCLC患者死亡的重要原因，80%以上的NSCLC患者在早期诊断或者治疗过程中发生转移^{［Reference 2-3

2-3］}。上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）是肿瘤转移的重要调控因子。在EMT过程中，肿瘤细胞的上皮标记物E-cadherin、ZO1的表达水平降低，间充质细胞的表型标记物N-cadherin、Vimentin、Snail与Slug等的表达水平上调，细胞的迁移与侵袭能力也明显增强，进而介导其自身的近端或者远端转移^{［Reference 4

Baidu Scholar

4］}。文献报道，抑制NSCLC的EMT的被认为是治疗转移性NSCLC的有效策略^{［Reference 5

Baidu Scholar

5］}。

雷公藤红素（celastrol）是中药卫矛科植物雷公藤中的三萜类活性成分之一，具有广泛的药理活性。雷公藤红素有良好的抗炎活性，可以显著抑制类风湿性关节炎、过敏性哮喘、肌萎缩侧索硬化^［

6］；雷公藤红素可以抑制小鼠的食物摄入，减少能量消耗，进而发挥减肥作用^{［Reference 7

Baidu Scholar

7］}；雷公藤红素也被证实具有良好的抗肿瘤活性，可抑制结肠癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的生长。初步的机制研究证实，雷公藤红素可能是通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、诱发自噬等方式发挥抗肿瘤作用的。近年来，有研究报道雷公藤红素可以抑制胰腺癌、结肠癌等的侵袭转移，但尚未明确雷公藤红素对NSCLC迁移侵袭的作用与分子机制^{［Reference 8-9

8-9］}。为此，本研究旨在评价雷公藤红素对NSCLC细胞NCI-H1299的迁移侵袭能力的影响，探索其初步的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

人NSCLC细胞株NCI-H1299细胞购买自美国ATCC。

1.1.2 药物与试剂

雷公藤红素（纯度>98%），上海陶素生化科技有限公司（批号：T2179）。雷公藤红素的配制：称取适量的雷公藤红素粉末，加入一定体积的DMSO溶解，配制成20 mmol/L的母液，避光置于-20 ℃保存。使用时用DMEM培养液将其稀释到实验所需浓度。

DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素，美国Gibico公司；CCK-8试剂盒、RIPA裂解液，上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室、Matrigel细胞培养板和细胞培养皿，美国Corning公司；Vimentin antibody、N-Cadherin antibody、Snail antibody、Slug antibody、ZO-1 antibody、E-cadherin antibody和HRP-linked Anti-rabbit IgG，美国Cell Signaling Technology公司；RNA提取试剂盒，上海擎科生物科技有限公司；cDNA转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒，日本TaKaRa公司；PVDF膜，德国Millipore公司。

1.1.3 主要仪器

HEPACLASS100型CO₂培养箱、EVOS XL Core型倒置显微镜，美国Thermo公司；5810R型低温离心机，德国Eppendorf公司；SECURA 125-10N型分析天平，德国Sartorius公司；Amersham Imager 600型凝胶成像系统，美国GE公司；LightCycler^®480型实时荧光定量PCR系统，德国Roche公司。

1.2 细胞培养

NCI-H1299细胞采用含10% FBS、1%链青霉素的DMEM高糖培养液培养，置于含5% CO₂、37 °C的恒温培养箱中培养，隔天换液。待细胞融合度约为90%，PBS清洗后用0.25%的胰酶消化传代，细胞传代的密度为2×10⁴个/ml。

1.3 细胞分组与干预方法

CCK-8增殖实验中，NCI-H1299细胞分为空白组和0~40 µmol/L雷公藤红素组，雷公藤红素的处理时间为48 h；其余实验设置空白组和雷公藤红素高、中、低（2.0 μmol/L、1.0 μmol/L和0.5 μmol/L）3个剂量组，每组3个复孔，实验重复3次。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 CCK-8法检测细胞的增殖活性

取对数增长期的NCI-H1299细胞接种于96孔板，每孔5×10³个细胞。24 h后弃去板中培养液，加入含不同浓度（0~40 μmol/L）的雷公藤红素培养液100 µl，每个浓度6个复孔，将细胞放入培养箱孵育48 h。弃去培养液，加入CCK-8工作液，培养箱避光孵育4 h。酶标仪测定吸光度，检测波长为450 nm。

1.4.2 伤口愈合实验检测雷公藤红素对NCI-H1299细胞的横向迁移能力的影响

收集对数增长期的NCI-H1299细胞按照每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板。待细胞融合度达到90%以上（约24 h），用无FBS的DMEM培养基饥饿6 h后。采用无菌的10 µl移液枪头在单层细胞上划“十”字，每孔2个“十”字。PBS洗去未贴壁的细胞后，随机将细胞分为空白组、雷公藤红素0.5 µmol/L组、雷公藤红素1.0 μmol/L组和雷公藤红素2.0 μmol/L组，且采用无FBS培养基将雷公藤红素稀释至相应的浓度，处理时间为24 h，分别在雷公藤红素加入的0 h和24 h选取相同视野倒置显微镜拍照，记录细胞的伤口愈合情况。

1.4.3 Transwell迁移实验检测雷公藤红素对NCI-H1299细胞的纵向迁移能力的影响

采用24孔Transwell培养板。取对数生长期的NCI-H1299细胞将其重悬于无FBS的DMEM中，按照2×10⁴个/孔的密度接种于Transwell上室，按照1.3中描述分组并给予相应的干预措施，下室加入含10% FBS的培养液。培养24 h后取出上室，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定5 min，0.1%结晶紫染色1 min，用棉签抹去小室上表面的细胞，自然干燥后倒置显微镜下选取随机3个视野进行拍照，记录细胞的迁移情况。使用IPP6软件分析细胞的迁移情况。

1.4.4 Transwell侵袭实验检测雷公藤红素对NCI⁃H1299细胞侵袭能力的影响

Traswell上室需用预冷的Matrigel包被（每孔45 µl），将小室放入培养箱中使Matrigel凝固。其余实验步骤与1.4.3中一致。

1.4.5 免疫印迹实验检测雷公藤红素对NCI⁃H1299细胞的EMT表型标记物表达的影响

取对数增长期的NCI-H1299细胞按照1×10⁶个/皿的密度接种于10 cm培养皿，24 h后加入不同浓度的雷公藤红素（0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和2.0 μmol/L）处理24 h。收集细胞，PBS清洗3次，1 000 r/min离心3 min收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液4 ℃裂解30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度后，加入5 × loading buffer 100 ℃加热5 min使蛋白变性。取40 µg蛋白进行SDS-PAGE电泳（80 V，20 min；120 V， 100 min），采用湿转法将SDS-PAGE上的蛋白转至PVDF膜上（300 mA， 100 min）。采用5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1 h，4 ℃孵育一抗过夜（一抗采用抗体稀释液稀释1 000倍）。TBST清洗3次后用相应的二抗（稀释2 000倍）室温孵育1 h。TBST清洗3次后避光加入适量ECL显影液，凝胶成像系统成像采集蛋白条带图像。采用β-actin作为内参。

1.4.6 实时荧光定量PCR检测EMT相关标记物的表达

取对数增长期的细胞接种于6孔板，不同浓度的雷公藤红素处理48 h后，收集细胞用RNA提取试剂盒提取RNA。测定RNA浓度后取1 µg RNA利用反转录试剂盒将其反转录成cDNA。实时荧光定量PCR采用20 µl体系进行反应，反应体系为：SYBR^® Green 10 μl，Forward Primer 0.4 μl，PCR Reverse primer 0.4 μl，DEPC水7.2 μl，cDNA 2 μl。将上述液体混匀后加入到96孔板中，用LightCycler^®480 System Real Time PCR仪进行扩增，扩增程序如下：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。采用2^-ΔΔCT法分析目的基因的相对表达水平，GAPDH为内参。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

基因名称	引物序列
N⁃cadherin	上游：5′-AGCCAACCTTAACTGAGGAGT-3′
N⁃cadherin	下游：5′-GGCAAGTTGATTGGAGGGATG-3′
Vimentin	上游：5′-GCCCTAGACGAACTGGGTC-3′
Vimentin	下游：5′-GGCTGCAACTGCCTAATGAG-3′
Snail	上游：5′-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3′
Snail	下游：5′-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3′
Slug	上游：5′-CGAACTGGACACACATACAGTG-3′
Slug	下游：5′-GCCTAGAGTTGCCGACTTATG-3′
E⁃cadherin	上游：5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′
E⁃cadherin	下游：5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′
ZO1	上游：5′-CCCCACTCTGAAAATGAGGA-3′
ZO1	下游：5′-GGGAACAACATACAGTGACGC-3′
GAPDH	上游：5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′
GAPDH	下游：5′-TGGAATTTGCCATGGGTGGA-3′

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1.5 统计学方法

采用Graphad Prism 8.0软件进行数据统计分析。实验数据以 $\bar{x}$ $\pm s$ 表示，多组间的差异采用one-way ANOVA中的Tukey’s test方法进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤红素对NCI⁃H1299细胞的增殖影响

CCK-8实验结果表明，雷公藤红素对NCI-H1299细胞增殖有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性，抑制作用随着浓度的升高而加强，IC₅₀为（9.50±1.25）μmol/L。雷公藤红素在低于2.5 μmol/L的浓度对NCI-H1299增殖影响较小，细胞活性>90%。为此，我们选取0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和2.0 μmol/L的剂量进一步评价雷公藤红素对NCI-H1299细胞的迁移侵袭能力的影响。见图1。

图1 不同处理组的NCI⁃H1299细胞的增殖活性

A：雷公藤红素结构式；B：雷公藤红素对NCI-H1299细胞增殖活性的影响

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2.2 雷公藤红素对NCI⁃H1299细胞的横向迁移能力的影响

采用伤口愈合实验评价雷公藤红素对NCI-H1299细胞的横向迁移能力的影响。实验结果表明，与空白组比较，雷公藤红素处理组的细胞伤口处的细胞明显减少，分别为空白组的72.74%、48.58%和28.46%，表明雷公藤红素可以剂量依赖性地抑制NCI-H1299细胞的横向迁移能力。见图2。

图2 不同处理组的NCI⁃H1299细胞的伤口愈合能力（n=3）

A：划痕实验的代表性结果；B：划痕实验的统计结果。与空白对照组比较，***P<0.001

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2.3 雷公藤红素对NCI-H1299细胞的纵向迁移能力与侵袭能力的影响

采用Trasnswell迁移与侵袭实验进一步评价雷公藤红素对NCI-H1299细胞的迁移与侵袭能力的影响。Transwll迁移实验中不同浓度的雷公藤红素作用后NCI-H199细胞的迁移数目明显降低，分别为空白组的75.82%、37.81%和19.46%。Transwell侵袭实验结果也表明，雷公藤红素可以明显抑制NCI-H1299的侵袭能力，抑制率分别为25.46%、50.83%和73.03%。

图3 不同处理组NCI⁃H1299细胞的迁移与侵袭能力（n=3）

A：transwell迁移与侵袭的代表性图片；B：transwell迁移与侵袭实验的统计结果。与空白对照组比较，**P<0.01，***P<0.001

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2.4 雷公藤红素对NCI-H1299细胞的EMT标记物表达水平的影响

采用蛋白免疫印迹实验检测雷公藤红素对NCI-H1299细胞EMT标记物的影响。蛋白免疫印迹实验结果表明，雷公藤红素作用后NCI-H1299细胞中的间充质细胞的标记物N-cadherin、Vimentin、Snail与Slug的表达水平明显减低，而上皮标记物E-cadherin与ZO1的水平明显升高，提示雷公藤红素抑制NCI-H1299细胞EMT过程。实时荧光定量PCR实验证实雷公藤红素剂量依赖性地降低N-cadherin、Vimentin、Snail与Slug mRNA水平，上调E-cadherin与ZO1 mRNA水平。

图4 不同处理组NCI-H1299细胞EMT标记物的表达水平（n=3）

A：western blot的实验结果；B：实时荧光定量PCR的实验结果。与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

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3 讨论

肺癌是我国发病率与病死率最高的恶性肿瘤之一。转移是导致NSCLC患者治疗失败与死亡的重要原因之一^［

10］。EMT被认为是肿瘤细胞获得侵袭转移能力的关键环节。EMT过程使得肿瘤细胞具有间充质细胞的表型，使其从原发肿瘤灶脱离，进入循环系统，最终转移至靶器官^{［Reference 4

Baidu Scholar

4］}。EMT相关标记物N-cadherin、Vimentin等在NSCLC中的表达水平也被证实与NSCLC患者的生存与预后密切相关^{［Reference 11

Baidu Scholar

11］}；抑制EMT也被认为是治疗NSCLC转移的有效策略^{［Reference 12

Baidu Scholar

12］}。

雷公藤红素是中药雷公藤的重要活性成分之一，已被证实具有较强的抗肿瘤作用。雷公藤红素可以通过诱导肿瘤细胞凋亡与坏死、抑制肿瘤细胞的增殖活力等方式抑制结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤的生长。雷公藤红素也被证实可以抑制NSCLC细胞A549的增殖、抑制EGF/EGFR及其下游信号通路的活化、调节凋亡相关蛋白Caspase3/9、下调CD146等方式发挥抗NSCLC的作用^［

9，13-14］。但是，雷公藤红素是否可以抑制NSCLC的迁移侵袭能力尚不明确。在本研究中也证实高浓度的雷公藤红素对NCI-H1299细胞的增殖有明显的抑制作用，IC₅₀为（9.50±1.25）μmol/L。伤口愈合实验、Transwell迁移与侵袭实验、蛋白免疫印迹实验与实时荧光定量PCR实验系统证实雷公藤红素在非毒剂量下可以明显抑制NCI-H1299细胞的迁移与侵袭能力，进一步的机制研究发现雷公藤红素可能是通过逆转EMT过程发挥抑制NCI-H1299细胞迁移与侵袭的作用。由此推测，雷公藤红素可以通过抑制NCI-H1299细胞的增殖与迁移、侵袭能力而发挥抗NSCLC的作用。此外，课题组前期研究发现雷公藤的另一活性成分雷公藤甲素在体内外均可以明显抑制NSCLC的侵袭与转移。初步的机制研究表明，雷公甲素可能是通过抑制β-catenin介导的EMT过程发挥抗NSCLC侵袭转移的作用^{［Reference 15

Baidu Scholar

15］}。鉴于雷公藤红素与雷公藤甲素的结构比较相似，我们推测雷公藤红素抑制NSCLC的迁移、侵袭与EMT过程可能也与调控β-catenin相关。我们将在后续的研究中进一步明确雷公藤红素抑制EMT过程的机制。

综上所述，本研究证实雷公藤红素可以明显抑制NSCLC细胞的迁移与侵袭能力和EMT过程，但雷公藤红素如何调控EMT的机制仍需进一步研究。

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摘要

目的,2,评价雷公藤红素对非小细胞肺癌NCI-H1299细胞的迁移与侵袭作用，并探讨其初步的作用机制。,方法,2,采用CCK-8实验评价雷公藤红素对NCI-H1299细胞增殖活性的影响，获得非毒剂量；采用伤口愈合实验和Transwell迁移实验观察雷公藤红素对NCI-H1299细胞迁移能力的影响；采用Transwell侵袭实验检测雷公藤红素对NCI-H1299细胞侵袭能力的影响；蛋白免疫印迹实验与实时荧光定量PCR实验检测雷公藤红素对NCI-H1299细胞中间充质标记物N-Cadherin、Vimentin、Snail、Slug与上皮标记物E-Cadherin、ZO-1的表达的影响。,结果,2,雷公藤红素可以呈剂量依赖性地抑制NCI-H1299细胞活性，在低于2.5 µmol/L的剂量下对其增殖无明显影响；雷公藤红素在0.5 µmol/L、1.0 µmol/L、2.0 µmol/L的剂量下可以抑制NCI-H1299细胞的迁移、侵袭能力；蛋白免疫印迹实验与实时荧光定量PCR实验结果表明，雷公藤红素能促进上皮标记物，抑制间充质标记物N-cadherin、Vimentin、Snail与Slug的表达，上调E-cadherin、ZO-1蛋白的表达。,结论,2,雷公藤红素可以明显抑制NCI-H1299细胞的迁移与侵袭能力，且这一作用可能与其逆转NCI-H1299细胞的上皮-间充质转化（EMT）相关。

Abstract

Objective： To investigate the effects of celastrol on the migration and invasion of non-small lung cancer NCI-H1299 cells and explore its preliminary mechanism.,Methods,2,CCK-8 assay was used to detect the effect of celastrol on the proliferation of NCI-H1299 cells， and non-toxic concentration was obtained. Wound healing assay and transwell migration assay were used to evaluate the effect of celastrol on the migration ability of NCI-H1299 cells. Transwell invasion assay was used to detect the effect of celastrol on the invasion ability of NCI-H1299 cells. Western blot and quantitative real-time PCR assays were conducted to detect the effect of celastrol on the expressions of mesenchymal markers N-Cadherin， Vimentin， Snail， Slug and epithelial markers E-Cadherin and ZO-1 in NCI-H1299 cells.,Results,2,Celastrol inhibited the proliferation of NCI-H1299 cells in a dose-dependent manner， and had no significant effect on the proliferation at a concentration lower than 2.5 µmol/L. Celastrol inhibited the migration and invasion of NCI-H1299 cells at the concentration of 0.5 µmol/L， 1.0 µmol/L and 2.0 µmol/L. The results of western blot and quantitative real time PCR assays showed that celastrol promoted epithelial markers， inhibited the expressions of mesenchymal markers N-cadherin， Vimentin， Snail and Slug， up-regulated the expressions of E-cadherin and ZO-1 protein.,Conclusion,2,Celastrol can significantly inhibit the migration and invasion ability of NCI-H1299 cells， and this effect may be related to its reversal of epithelial mesenchymal transition （EMT） of NCI-H1299 cells.

关键词

雷公藤红素非小细胞肺癌迁移侵袭上皮-间充质转换

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